论文部分内容阅读
目的探讨烟草烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)对C2C12小鼠成肌细胞炎症因子(IL-8、TNF-α)、转录因子核因子-κB(nuclear facter-κB,NF-κB)及组蛋白去乙酰化酶-2(histone deacetylase 2,HDAC2)的影响。方法(1)观察不同浓度CSE对细胞生长的影响:以C2C12小鼠成肌细胞为研究对象,待C2C12细胞分化为成熟的肌细胞,用CSE刺激C1C12细胞制造细胞氧化应激模型。采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法确定浓度分别为 0.1%、0.2%、0.4%的CSE在24h、48h、72h时间点对细胞生长的影响,以选择孵育C2C12细胞的合适作用浓度。(2)观察CSE对C2C12细胞释放炎性介质的影响:将分化好的细胞按以下分组干预,对照组、0.1%CSE 组(0.1%CSE 孵育细胞 24 小时)、0.2%CSE 组(0.2%CSE 孵育细胞24小时)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液的炎症因子IL-8和TNF-α的浓度。(3)观察CSE对C2C12细胞HDAC2及炎症介质的影响,将分化好的细胞分为:对照组、CSE组、HDAC2-siRNA 组(HDAC2 抑制组)、HDAC2-siRNA+CSE 组。CSE组即用合适浓度的CSE刺激细胞24小时,HDAC2-siRNA组即用脂质体Lipofectamine 2000将构建好的组蛋白去乙酰化酶2沉默RNA(HDAC2-siRNA)转染细胞,HDAC2-siRNA+ CSE 组即先用脂质体Lipofectamine2000做瞬时转染,沉默HDAC2基因,24 h后再用CSE孵育细胞。实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot法检测HDAC2的表达情况,比色法测定各组细胞HDAC2活性,ELISA检测细胞培养上清IL-8、TNF-α的含量。(4)观察CSE对细胞NF-κB及炎症介质的影响,将培养的细胞分为:对照组、CSE组、PDTC组(NF-κB抑制剂组)、PDTC+CSE组。CSE组即用CSE刺激细胞24小时,PDTC组即用NF-κB抑制剂PDTC(20uM)孵育细胞24小时,PDTC+CSE组即用NF-κB抑制剂PDTC预孵育细胞24小时后,再用CSE刺激细胞。Western blot法检测NF-κB的表达情况,ELISA检测细胞培养上清IL-8、TNF-α的含量。(5)探讨HDAC2与NF-κB的相互作用,将分化好的细胞分为:对照组、0.1%CSE组、0.2%CSE组。免疫共沉淀方法检测细胞HDAC2/NF-κB p65复合物水平,Western blot法检测乙酰化NF-κB p65水平。数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。结果(1)浓度为0.1%、0.2%的CSE作用细胞24h对C2C12细胞生长无明显影响。(2)CSE刺激C2C12细胞24小时后,细胞IL-8、TNF-α释放增加,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。(3)CSE孵育细胞24小时后,细胞HDAC2的表达及活性均下降,IL-8、TNF-α水平升高。沉默HDAC2基因后再用CSE孵育细胞,细胞HDAC2表达和活性与对照组及CSE组相比均明显下降,IL-8、TNF-α升高更为明显。作为阴性对照,HDAC2-siRNA组细胞HDAC2的表达水平及活性均明显低于对照组(P<0.05)。(4)CSE孵育细胞24小时后,NF-κB表达水平明显高于对照组,细胞释放IL-8、TNF-α的水平与对照组相比明显增高。NF-κB抑制剂PDTC孵育细胞后再用CSE刺激细胞,NF-κB的表达水平与CSE组相比明显下降,细胞释放IL-8、TNF-α的水平明显低于CSE组。作为阴性对照,PDTC组细胞NF-κB的表达水平明显低于对照组。(P<0.05)。(5)CSE作用下C2C12细胞HDAC2/NF-KB p65复合物表达增多,NF-κB p65的表达增多伴随着HDAC2的表达下降;CSE作用下细胞乙酰化的NF-κB p65表达增高,且具有浓度依赖性(P<0.05)。结论(1)在CSE刺激下C2C12小鼠成肌细胞通过下调HDAC2、上调NF-κB表达使IL-8、TNF-α表达增多。(2)CSE作用下HDAC2/NF-κB p65复合物及乙酰化的NF-κB p65表达增多,HDAC2与NF-κB p65具有相互作用。