家蚕（Bombyx mori）是一种重要的经济昆虫,以家蚕为对象开展研究既能为其他昆虫或者哺乳动物提供一定的理论基础,也能为养蚕业指引新的方向。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是一类对蚕业生产危害严重的病原,世界各地养蚕业往往由于该病毒导致的蚕病而承受巨大的经济损失。长期以来,对这种病毒病还没有很好的防治方法。尽管目前已有一些家蚕抗BmNPV品系报道,也有基于抗性品系和易感性品系开展组学研究筛选抗性靶标,但目前尚未找到在家蚕个体上可以应用的关键分子。基于本课题组对家蚕BmSTING依赖的抗病毒信号机制解析,发现家蚕BmCaspase＿8 like（BmCasp8L）可能作为一个免疫负调控分子应答BmNPV的感染,但其作用机理尚未探明。可否通过解除BmCasp8L的免疫抑制作用提高宿主的先天免疫,从而增强宿主的抗病毒能力,尚有待进一步的探索和研究。本文利用以先天免疫方式为主的鳞翅目模式昆虫—家蚕和其DNA型病毒BmNPV为研究材料,通过对BmCasp8L在家蚕应答BmNPV感染免疫中发挥的作用进行研究,解析BmCasp8L发挥作用的主要机制并鉴定了其发挥作用的关键位点,为家蚕抵御BmNPV病毒增殖的机制和家蚕BmNPV抗性素材的创制提供理论基础。在本文中,我们首先利用转基因技术获得了BmCasp8L过表达品系,并通过病毒感染实验解析了其在抗病毒防御中的作用;进一步在细胞上对BmCasp8L分别进行了干涉和过表达,证明其对BmNPV的增殖是否发挥作用;此外,对BmCasp8L发挥作用的关键区域进行分析,鉴定了其发挥作用的关键位点。最终利用CRISPR/Cas9技术和杂交筛选,获得了BmCasp8L敲除品系,其对病毒的抵御能力正在研究中。基于以上研究,获得的主要研究结果如下:1、在家蚕应答BmNPV感染免疫中,BmCasp8L发挥负调控作用通过转基因过表达技术,我们成功获得了BmCasp8L过表达品系,对其进行突变检测发现,无论是转录水平还是蛋白水平都显示相较于野生型,过表达品系体内BmCasp8L的表达量显著升高。对野生型和BmCasp8L过表达家蚕的4龄起蚕分别进行BmNPV病毒感染实验,发现相较于野生型,过表达BmCasp8L的家蚕会更快地死亡。感染BmNPV病毒后进行q PCR检测发现BmCasp8L过表达家蚕体内的病毒DNA量也明显高于野生型。对抗病毒信号通路NF-κB信号通路下游的抗菌肽分子进行检测发现,过表达家蚕的抗菌肽表达量显著低于野生型,表明家蚕BmCasp8L在家蚕应答BmNPV感染免疫中发挥着负调控作用。为了进一步验证该结论,我们对细胞感染病毒后内源性BmCasp8L的表达模式进行分析。发现随着病毒增殖时间的延长,病毒滴度呈现持续增加的趋势。而BmCasp8L的表达在感染前期有小幅度的下降,感染后期则持续增长。利用病毒分别感染过表达和干涉BmCasp8L后的细胞,发现其相较于正常细胞,BmCasp8L过表达细胞中抗菌肽的表达显著降低,病毒的增殖显著增多;而干涉BmCasp8L后的细胞抗菌肽表达显著上升,病毒的增殖显著降低。以上实验进一步证明BmCasp8L在家蚕防御BmNPV病毒过程中发挥抑制作用,而降低BmCasp8L的表达可以抑制病毒在细胞内的复制。2、BmCasp8L发挥负调控作用的关键位点鉴定BmCasp8L和BmDredd均是NF-κB信号通路的关键调控分子,而氨基酸序列分析发现BmCasp8L与BmDredd高度同源。为了进一步探索BmCasp8L发挥负调控作用的机理,我们将BmDredd、BmRelish和BmCasp8L在细胞中共表达,发现BmDredd的增多,可以显著减弱BmCasp8L对BmRelish活化的抑制作用,而当细胞中不存在外源表达的BmCasp8L时,其对BmDredd促进的BmRelish活化抑制减至最低,抗菌肽分子的表达被显著提高,病毒的增殖也受到明显抑制。为了进一步探索BmCasp8L发挥负调控作用的机制,首先构建了BmCasp8L的稳定敲除细胞系。对敲除位点进行检测,测序结果显示:在BmCasp8L的sgRNA1位点存在63.6%的翻译终止和36.4%的氨基酸缺失,sgRNA2位点存在88%的翻译终止和12%的氨基酸缺失。蛋白水平检测也显示该蛋白在转基因敲除细胞系的表达显著降低。紧接着我们在BmCasp8L敲除细胞系中过表达BmDredd,发现BmDredd促进的caspase-3活性显著增强,暗示BmCasp8L可以抑制BmDredd的活性。而在细胞中将BmCasp8L和BmDredd共表达后,有趣的是,BmDredd的活性条带减弱时,BmCasp8L的条带也减弱。泛素化抗体检测进一步发现,BmDredd的存在可以增强BmCasp8L的泛素化。对BmCasp8L进行同源分析和结构域预测发现,Casp8L在人、果蝇和家蚕中高度同源,且都存在DED结构域和cRHIM基序。分别对BmCasp8L的两个独立的DED结构域进行截短,将与其泛素化作用增强可能相关的cRHIM基序突变和加倍后的不同形式构建至真核表达载体,检测发现BmCasp8L的全长和不同形式在细胞中均可以表达。随后,将BmCasp8L全长和其不同形式的突变体与BmDredd共转后,其Western-blot检测发现DED2功能域的缺失可以显著减弱BmCasp8L全长蛋白在BmDredd存在时的降解,而cRHIM基序的突变可以使BmCasp8L的降解减弱;当cRHIM基序增加2倍或4倍与BmDredd共表达后,BmCasp8L蛋白的降解显著加剧。以上结果表明BmCasp8L自身泛素化增强的关键基序是cRHIM基序。进一步在细胞中将不同形式的BmCasp8L分别与BmRelish共同表达,发现cRHIM基序的增多能够显著减弱其对BmRelish活化的抑制作用。以上结果表明,cRHIM基序是BmCasp8L发挥负调控作用的关键位点。cRHIM基序的增多能够显著减弱BmCasp8L的负调控作用,进而促进NF-κB信号通路激活,进而抑制病毒的增殖。3、BmCasp8LKO抗性素材创制通过CRISPR/Cas9技术,利用细胞上已验证可以实现敲除作用的sgRNA构建用于个体敲除的转基因载体。随后将转基因载体显微注射至D9L蚕卵中,筛选得到了阳性的BmCasp8L sgRNA家蚕,与Cas9家蚕进行杂交后通过荧光筛选得到了BmCasp8LKO的F1代。对BmCasp8LKO家蚕进行转基因敲除效果检测发现,在BmCasp8L的sgRNA1位点存在50%的移码突变,在sgRNA2位点也存在85.7%的移码突变,而sgRNA1和sgRNA2位点同时发生移码突变的有57%。以上结果表明,我们获得的BmCasp8LKO家蚕已经发生大于50%的敲除突变,自交后代可以用于攻毒检测。对BmCasp8LKO家蚕与野生型家蚕的经济性状进行了统计,结果显示相较于野生型,BmCasp8LKO家蚕的茧重显著升高,然而其蛹重和茧层率与野生型并没有明显差异,且饲养过程中BmCasp8LKO家蚕与野生型家蚕发育特征无明显差异。进一步我们将BmCasp8LKO家蚕与野生型进行测交,将测交后代不断自交筛选无光的纯和突变体,用于抗性素材的创制。