鲤鱼NLR-C基因克隆及其特性分析

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天然免疫作为抵御微生物或其他异物入侵机体的第一道防线,在免疫防御中具有重要作用,因此越来越受到免疫研究工作者的关注,成为免疫学研究的热点。NLR是一种重要的胞内模式识别受体,能够识别多种病原微生物成分,引起免疫应答,在天然免疫中发挥重要的防御功能。NLR-C是新近发现的硬骨鱼中特有的一类NLR基因家族成员,目前对其在鱼类中的免疫功能及其作用机制的研究报道还很少。本研究首先对已报道鱼类NLR-C基因cDNA序列进行比对,根据保守区设计引物,利用反转录PCR和RACE技术首次克隆得到了鲤鱼(Cyprinus carpio L.) NLR-C基因cDNA全长。NLR-C基因cDNA序列全长为3665bp,包含100bp的5-非编码区(5’-UTR),3078bp的开放阅读框(ORF)及487bp的3-’非编码区(3’-UTR),根据ORF序列推导该基因编码1025个氨基酸。在SMART网站上对其进行结构预测分析,结果显示鲤鱼NLR-C主要包含核苷酸结合域(NACHT)、亮氨酸富集重复区(LRR)和一个额外的PRY/SPRY (B30.2)域等3个结构域,具有典型的鱼类NLR-C特征结构。鲤鱼NLR-C与斑马鱼、牙鲆等几种硬骨鱼NLR-C的氨基酸序列进行比对,结果发现在硬骨鱼中NACHT、LRR和B30.2等3个结构域具有很高的保守性。对不同物种NLR家族的氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示,鱼类NLR-C单独形成一个分支,表明鱼类的NLR-C是鱼类所特有一个NLR亚族。对NLR家族NACHT结构域的进化分析显示鱼类NLR-C亚族与NLRC3亚族的亲缘关系最近。利用Real time-PCR检测NLR-C基因在鲤鱼不同组织中表达分布,结果表明,NLR-C基因在鲤鱼鳃、皮肤、脑、脾脏中表达量最高,在口腔上皮、前肠、后肠中也有较高表达,在性腺中的表达水平最低。鳗弧菌(V.anguillarum)浸泡刺激实验结果显示,鲤鱼皮肤和后肠NLR-C mRNA的表达量都呈现明显的下降趋势;肝脏、脾脏和头肾中的表达量无显著性变化;前肠和鳃中分别在3h和6h开始有不同程度的上升,随后开始有恢复到正常水平的趋势。鳗弧菌注射刺激后,肝脏、脾脏、头肾、后肠、鳃、皮肤、前肠中NLR-C mRNA的表达量都有明显上升,随后有恢复的正常表达水平的趋势。在脾脏和头肾中上升倍数比较明显,在头肾中,3h表达升高到最高水平;在肝脏和脾脏中,6h达到最大水平;在前肠中,48h达到最高;在鳃、皮肤和后肠中,24h达到最高水平。鳗弧菌浸泡和注射刺激后,鲤鱼的头肾和后肠中都检测到了IL-1β mRNA有不同程度的上升。以上研究结果显示NLR-C在鲤鱼抵抗鳗弧菌的天然免疫反应中发挥一定作用。
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