沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌共增和同时检测方法研究

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本研究提出一种能够同时富集沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌却对其他杂菌有抑制作用的共增菌培养基,命名为SSS肉汤。通过观察记录沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和其他杂菌在SSS肉汤中的生长情况,本研究对该共增菌培养基进行了评估,验证有效性。另外通过建立沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌多重荧光PCR反应,本研究提出了对这三种细菌的SSS肉汤增菌-多重荧光PCR检测方法,通过实际样品试验,证明了实用性。SSS肉汤的基本成分为:胰蛋白胨,大豆蛋白胨,磷酸二氢钾,葡萄糖,氯化钠。在众多的添加剂中,通过筛选,最终确定抑制剂为:氯化锂、牛胆盐、亚碲酸钾;促进剂为甘露醇。SSS肉汤的最终配制方法是:称取胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g,磷酸二氢钾2.5g,葡萄糖2.5g,氯化钠35g,氯化锂0.5g,牛胆盐0.1g,甘露醇2g添加到990mL蒸馏水中,加热溶解。冷却至室温后矫正pH为7.2。称取0.3mg亚碲酸钾溶解入10mL已灭菌的蒸馏水中,得到亚碲酸钾溶液。在无菌条件下,10mL亚碲酸钾溶液加入原990mL体系中。所得培养基分装贮存于4-6℃。命名该培养基为SSS肉汤。评估结果显示,不论是在初始浓度为10CFU/mL还是1000CFU/mL,沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌在SSS肉汤中单独增菌18h后,浓度都能达到107CFU/mL以上,完全能够达到荧光PCR反应的检测限;在沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌初始浓度比例分别为1000CFU/mL:1000CFU/mL:1000CFU/mL,10CFU/mL:1000CFU/mL:1000CFU/mL,1000CFU/mL:10CFU/mL:1000CFU/mL,1000CFU/mL:1000CFU/mL:10CFU/mL时,经过在SSS肉汤中增菌18-20h后,各菌的浓度都能达到107CFU/mL;非目标菌株大肠杆菌O157、蜡样芽胞杆菌、小肠耶尔森氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌和绿脓杆菌的生长则受到抑制。其中蜡样芽胞杆菌、小肠耶尔森氏菌和绿脓杆菌完全不能生长,大肠杆菌O157、副溶血性弧菌和变形杆菌生长受到抑制,18h生长后菌液浓度低;沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的特异性基因分别为invA,ipaH,sa442,然后分别选取其保守序列设计引物和探针。Blast比对证明所设计的引物和探针具有高度的保守性。对于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌而言,引物最佳的浓度为:0.5μmol/L,0.5μmol/L和0.5μmol/L;探针最佳的浓度为0.2μmol/L,0.2μmol/L和0.2μmol/L。选择BSA和甲酰胺作为PCR反应促进剂,在PCR反应体系中加入0.04%(w/v)BSA和0.01%(w/v)甲酰胺。扩增曲线显示,沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌在单独存在和共同存在的情况下都能够良好的扩增。人工接种试验显示,SSS肉汤-荧光PCR反应与传统方法的结果符合率为100%,时间节省了50%。证明SSS肉汤-荧光PCR法是一种能够高效、快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。
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