论文部分内容阅读
目的本实验从人食管鳞状细胞癌细胞系Eca-109着手,运用细胞培养、Transwell细胞迁徙、免疫细胞化学、实时定量PCR和Western blotting等实验技术研究TLR4信号通路在食管癌发生发展中的作用;首次将TLR4特异性抑制剂TAK-242与抗肿瘤药物奥沙利铂(OXA)联合应用于Eca-109细胞系,探讨二者联合作用后可能产生的相互作用。为食管癌分子靶向治疗药物的研发与临床联合用药治疗提供参考。方法1.MTT法测细胞活性96孔板铺人食管鳞状癌细胞Eca-109,密度为1×105个/m L,每孔加约2000个细胞,即200μL。细胞分为空白组;对照组;OXA处理组(终浓度):浓度分别为6.25,12.5,25,50,100μM;TAK-242处理组:浓度分别为12.5,25,50,100,200nM;联合用药组:25μM OXA组+100nM TAK-242。用无菌PBS冲洗各组细胞微孔,并加入200μL MTT,使终浓度为5mg/mL,在培养箱内培养4h,加入DMSO,在摇床上摇匀10min,用酶标仪检测490nm处各微孔的吸光度值。先统计分析单药组各浓度抑制率再选择联合用药适宜的浓度。每次实验操作重复三次。2.细胞联合用药培养细胞分组为Vehicle(a)、100nM TAK-242组(b)、25μM OXA组(c)、100nM TAK-242+25μM OXA组(d);采用6、12、24孔板,培养皿(直径10cm),Transwell小室培养四组细胞并提取RNA、蛋白质、制备细胞爬片等以完成相应实验。3.Transwell细胞迁徙细胞加药处理12h后,先用PBS重悬细胞两次,再用含0.1%BSA的1640培养液重悬,细胞计数,使用密度为5×105个/mL,使每孔约1万个细胞,即铺Transwell上室200μL;上下室培养液形成浓度差使细胞穿孔48h;风干小室后用0.1%结晶紫染色30min,小心擦去上室膜上未穿孔的细胞;镜下随机拍5个视野进行细胞计数,用平均值表示细胞迁徙的能力大小。每次实验操作重复三次。4.细胞免疫化学首先制备细胞爬片,药物处理四组细胞12h;4%多聚甲醛固定15min,空干5min,0.5%TritonX-100穿孔20min,3%H2O2封闭10min,0.5%BSA配制的一抗4℃过夜,室温孵育1h,含HRP的二抗37℃孵育30min,DAB染色,脱水透明,封片,倒置显微镜下观察,拍照;Image-Pro Plus软件分析光密度值。每组实验重复三次,计算平均光密度值。5.RT-qPCR采用Trizol法提取四组细胞总RNA,根据A260/A280与A260/A230的值判断RNA提取质量。RNA逆转录合成cDNA主要步骤:总RNA量1.0μg,其他试剂用量参照cDNA Reverse Transcription Kit说明书,无核酶水定容20μL;充分混匀后短暂离心;逆转录PCR步骤:25℃10min,37℃120min,85℃5min,4℃forever;cDNA于-20℃保存。实时定量PCR扩增体系(单个样品用量):前引物(10 uM)、后引物(10 uM)各0.8μL,SYBR?Green Master Mix 10.0μL,cDNA 2.0μL,去离子水6.4μL,总体积20μL;qPCR反应程序:95℃1 min,95℃15 s,60℃15 s,72℃45s此处搜集,共40个循环;熔解曲线65℃-95℃。实验结果观察扩增曲线和融解曲线,根据所得Ct值应用2-ΔCt方法计算相应基因mRNA的相对表达量,每个样品做3个重复。6.Western blotting洗涤和收集培养的四组细胞,加入RIPA lysis buffer含1%蛋白酶抑制剂cocktail,冰上裂解30 min,于4℃13000 rpm离心14 min收集上清;根据BCA protein assay kit说明书绘制标准曲线,测定样品562 nm处的吸光度值,计算相应蛋白浓度;聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳(6%、10%、12%分离胶,5%浓缩胶),每泳道蛋白质上样量为40μg,浓缩胶恒压90V跑电泳,20min,分离胶恒压120V,1h,采用恒流200m A湿转将蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,一抗(分别是GAPDH,TLR4,MyD88,TRIF,NFκB-p65)4℃过夜,充分洗涤后加入相应种属的二抗,ECL显色;具体实验操作时间依据目的蛋白大小而定。Image J软件分析各条带灰度值。每组实验重复三次。7.统计学分析实验结果用mean±SD表示,SPSS Statistics 17.0软件处理实验数据,组间均数比较采用Student-t检验,P<0.05为差异有显著性,P>0.05为差异无显著性。结果1.MTT实验结果单药组随药物以浓度梯度依赖性方式降低Eca-109细胞的生存率,OXA药物浓度在25μM以上可显著抑制其生长(P<0.001),TAK-242药物浓度在100nM以上可显著抑制其生长(P<0.001),25μM OXA与100nM TAK-242联合用药对Eca-109的生长抑制作用较单药组显著(P<0.001)。2.细胞迁徙实验结果用药组与空白组比较Eca-109细胞穿过膜的能力均有下降(P<0.01);与单药组比较,联合用药组Eca-109细胞穿过膜的能力显著降低(P<0.01)。3.细胞免疫组化结果Eca-109细胞爬片免疫化学染色结果以胞浆或胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。用Image-pro-Plus 5.1分别测得四组细胞爬片MyD88、TRIF、NFκB-p65的光密度值,结果显示,TAK-242组、联合用药组MyD88、TRIF、NFκB-p65的平均光密度值均较对照组的平均光密度小(P<0.05)。4.细胞表达mRNA的结果加药组和对照组比较,加入TAK-242可下调Eca-109细胞MyD88、TRIF、NFκB-p65 mRNA水平(P<0.05),联合用药组比其它组低(P<0.05)。5.Western-blotting结果检测四组Eca-109细胞的TLR4、MyD88、TRIF、NFκB-p65蛋白表达情况,结果显示,与对照组比较,TAK-242组、联合用药组TLR4、MyD88、TRIF、NFκBp65蛋白的表达均有下调(P<0.05)。结论TAK-242能增强OXA对人食管鳞状癌细胞Eca-109的体外增殖抑制作用和促进其迁徙能力是通过有效下调Eca-109的MyD88、TRIF、NFκB-p65的mRNA的表达和抑制Eca-109的TLR4及其下游主要蛋白MyD88、TRIF、NFκB-p65的表达实现的。表明了TLR4信号通路在肿瘤中的作用是非常重要的,TAK-242与OXA联合用药能抑制肿瘤的生长抑制癌症的转移具有很大的临床应用价值。