竹黄多糖的液体发酵及其抗氧化活性与结构的研究

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竹黄是竹枝上的寄生真菌,其子座作为一种中药,具有很高的药用价值,可用于治疗各种疾病,如类风湿性关节炎、坐骨神经痛、肝损伤和慢性支气管炎等。苝醌类化合物和多糖是其基质提取物中最重要的活性成分,目前研究表明竹黄多糖对小鼠肝损伤具有保护作用,并具有一定的抗氧化活性和抗炎活性。目前市场上的竹黄基质供应有限,而液体发酵是一种可有效且快速的大规模生产药用真菌的方法。因此在本课题中,首先以两个不同产地竹黄子座中分离得到的两种竹黄菌为基础,通过液体发酵获得两种竹黄菌丝体多糖,研究了两种菌丝体多糖的生物生产力,抗氧化性能和免疫调节活性,并与相应子座多糖进行比较;进一步探索了液体发酵过程中培养基成分及发酵条件对多糖的含量及抗氧化活性的影响,构建了液体发酵竹黄多糖培养体系;最后对粗多糖进行了分离纯化,对得到的单一多糖组分进行了结构鉴定和解析。论文主要结果如下:(1)子座多糖与菌丝体多糖生物生产力及生物活性的测定:采用水提醇沉法分别从两个产地的竹黄子座和对应的菌丝体中提取粗多糖,通过对多糖的生物生产力,抗氧化性能和免疫调节活性的测定,结果表明,在100 g发酵菌丝的冻干生物质中,产生了9.12±0.36 g浙江竹黄菌丝体多糖(ZSIP),而浙江子座多糖(ZSSP)产量为3.94±0.92g/100 g生物质(DM)。同时,云南竹黄菌丝体多糖(YSIP)及云南竹黄子座多糖(YSSP)产量分别为5.44±0.28 g/100g DM和2.33±1.14 g/100 g DM。另外,在浓度为5 mg/m L时,ZSIP和ZSSP的羟基自由基清除活性分别为89.29%±1.36%和47.54%±1.12%。同时,5mg/m L的YSIP的羟基自由基清除活性为70.02%±1.02%比YSSP(56.10%±0.89%)更高。并且,ZSIP和YSIP在3 mg/m L的浓度下具有100%的2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)铵盐(ABTS)自由基清除活性,相当于0.025 mg/m L的抗坏血酸。而免疫调节结果表明,ZSIP比ZSSP更好地增强了RAW264.7巨噬细胞中IL-6的产生,同时增加了诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的产生。综上可知,通过液体发酵显著提高了竹黄多糖的生物生产力和生物活性。(2)液体发酵竹黄多糖培养体系的构建及优化:考察了培养基及发酵条件对液体发酵后竹黄多糖含量及抗氧化活性的影响。通过单因素试验确定了液体发酵培养基的基本组份为(g/L):30 g甘露醇,24 g马铃薯葡萄糖,2.25 g鱼粉蛋白胨,1 g K2HPO4·3H2O和0.50 g Mg SO4·7H2O,p H自然;正交试验确定发酵条件为:接种量2%(v/v),培养时间60 h,初始p H 7,在此条件下菌丝体多糖产量达到了11.85±0.42 g/100 g DM。(3)竹黄多糖的分离纯化及构效关系分析:采用Sevag法和Sephadex G-150柱层析结合制备液相得到两种纯多糖分别命名为SIP-1和SIP-2。采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法检测SIP-1和SIP-2的分子量分别为5.71×103k Da和0.10×103k Da。采用高效液相色谱(HPLC)测得SIP-1和SIP-2的单糖组成都由甘露糖、葡萄糖和半乳糖构成,摩尔比分别为1.00:7.26:1.09和1.00:1.52:1.05。利用红外光谱和核磁共振扫描对两种纯多糖进行了进一步的结构研究,结果表明,SIP-1为主要含有α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃半乳糖的α-吡喃型葡聚糖;而SIP-2为含有β-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃甘露糖和β-D-吡喃半乳糖的β-吡喃型葡聚糖。进行纯多糖体外抗氧化活性测定发现,在2 mg/m L时,SIP-1和SIP-2的羟基自由基清除率分别为39.76%±0.57%和91.22%±2.97%;同时,在4mg/m L时,较SIP-1的ABTS+自由基清除率(67.40%±3.61%)而言,SIP-2具有更强的清除能力(99.07%±0.99%)。不同结构特征或许是导致其抗氧化活性不同的原因。此研究对竹黄多糖发酵具有重要意义,并为开发其他高生物活性的药用真菌产品提供了新的思路,具有理论意义和应用价值。
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