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1-O-乙酰基大花旋覆花内酯(ABL)是欧亚旋覆花中含量较高的活性成分之一,为倍半萜内酯类化合物,具有抗肿瘤活性,但其稳定性和溶解性都不太好,本实验所用的药物是ABL的衍生物,简称ABL-N。目的:观察ABL-N对小鼠白血病细胞L1210增殖和凋亡的影响,并初步探讨其作用的机制。方法:(1) MTT法测定ABL-N对小鼠白血病细胞L1210增殖的影响:取细胞培养于96孔培养板内,培养24 h后,给药组加入不同浓度的ABL-N溶液,对照组加与最高浓度组等量的DMSO。分别培养24 h、48 h、72 h后用Fluo-star在检测波长570 nm条件下测定光密度值(OD value),计算各浓度的ABL-N对L1210细胞的抑制率。(2)台盼蓝拒染法检测ABL-N对L1210存活细胞数的影响。取对数生长期的细胞,给药组给予不同浓度的ABL-N溶液,对照组加与最高浓度组等量的DMSO。培养后的分别于第24 h、48 h、72 h取样,台盼蓝染色,计数活细胞,用活细胞数对时间绘制生长曲线。(3)通过瑞氏-吉姆萨染色和Hochest 33258染色观察ABL-N作用48 h后L1210细胞的形态变化。收集ABL-N(20 mg/L)处理后的细胞,进行染色,观察细胞形态学变化。(4)用流式细胞仪测定ABL-N作用后L1210细胞的凋亡率和周期分布。取对数生长期的细胞,给予ABL-N(10、20 mg/L)作用48 h后,PI染色,在流式细胞仪上测定各组细胞的凋亡率和周期分布。(5)Western-blot法检测ABL-N作用后L1210细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的变化。(6)免疫荧光法检测ABL-N作用后L1210细胞p53蛋白表达的变化。结果:(1)用不同浓度ABL-N(5、10、20 mg/L)分别处理L1210细胞24 h后抑制率分别为14.6%、38.5%、47.4%。作用48 h时抑制率分别为28.8%、63.2%、74.8%。72 h后抑制率分别为35.7%、81.5%、91.6%。表明ABL-N可明显抑制L1210细胞的增殖,并呈现出浓度和时间依赖性。(2)用不同浓度ABL-N(5、10、20 mg/L)作用于L1210后,从生长曲线可以看出明显的浓度效应关系,且高浓度组加药1 d后及中浓度组加药2 d后,活细胞数量减少,说明ABL-N对体外培养的小鼠白血病L1210细胞有较强的抑制作用及杀灭作用。(3)本研究采用Giemsa染色及Hoechst 33258荧光染色方法分别观察了ABL-N作用于L1210细胞48 h后的形态变化,2种染色方法均显示给药组细胞呈现核聚集和碎裂等凋亡特征性形态学变化。(4)不同浓度的ABL-N(10、20 mg/L)作用48 h后凋亡率分别为13.6%、29.9%。溶剂对照组的凋亡率为3.57%。可见ABL-N作用后凋亡率明显的增加。(5)ABL-N(10、20 mg/L)作用48 h后G1期细胞数量由26.8%增加到30.9%、51.4%,S期细胞数量由73.2%下降到69.1%、48.6%。(6)不同浓度的ABL-N(5、10、20 mg/L)作用48 h后,Bax/β-actin比例由0.49分别增加到0.58、0.71(P<0.01)、0.82(P<0.01)。Bcl-2/β-actin比例由0.66分别下降到0.61、0.57(P<0.05)、0.28(P<0.01)。Bcl-2/Bax比值由1.36分别下降到1.17、0.80(P<0.01)、0.34(P<0.01)。(7)对照组p53蛋白表达的荧光强度为63.5。不同浓度的ABL-N(5、10、20 mg/L)作用48 h后的荧光强度分别为83.3(P<0.05)、188.0(P<0.01)、242.5(P<0.01),有了明显的增强。结论:(1)ABL-N能明显抑制小鼠白血病细胞L1210的增殖。(2)ABL-N对L1210细胞有明显的细胞毒性。(3)ABL-N影响细胞周期动力学,使细胞停滞在G1期。(4)ABL-N抑制L1210细胞增殖作用可能与影响细胞周期动力学有关。使细胞停滞在G1期,影响了DNA的合成。(5)ABL-N能诱导L1210细胞凋亡,这可能与上调p53和Bax,下调Bcl-2蛋白的表达有关。其上调p53蛋白表达可能与使细胞停滞在G1期有关。