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目的:肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)突变基因C9orf72相关二肽重复(DPR)蛋白poly-PR已经被证实具有很强的神经毒性,且DPR具有类似于疯牛病蛋白(prion)的细胞间传递特征。但是对于其导致神经细胞退变的分子机制以及传递机制尚不清楚,因此我们设计相关实验探究poly-PR导致神经元死亡的分子机制。方法:使用合成的poly-PR(20个PR重复,PR20)多肽以及慢病毒载体表达poly-PR(28个PR重复,PR28)来处理SH-SY5Y细胞(神经元细胞系)和小鼠原代皮层神经元进行实验。使用细胞内吞相关途径的抑制剂探索poly-PR多肽进入神经元的内吞机制。然后使用流式细胞术(Flow cytometry)测定标记了 FITC的poly-PR荧光强度,从而定量内吞抑制剂使用后对poly-PR多肽进入神经元的抑制效果。其次使用RNA干扰(RNAi)技术来验证poly-PR进入神经元的内吞方式。通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验和Propidium iodide(PI)染色实验检测poly-PR对神经元的毒性。使用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测poly-PR处理后神经元的内质网应激(ER stress)标志蛋白CHOP,磷酸化的JNK和促凋亡因子p53和Bax等的蛋白表达水平。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time qPCR)检测poly-PR处理后神经元的内质网应激标志蛋白和促凋亡因子相关转录(mRNA)水平。同时利用免疫荧光实验(Immunofluorescence)检测poly-PR对促凋亡因子p53和caspase-3活化影响。利用LDH释放实验和PI染色实验检测相关抑制剂阻断poly-PR的神经毒性效果,同时利用Western blot检测相关抑制剂加入后细胞内质网应激标志蛋白CHOP和促凋亡相关因子等的表达水平。结果:利用细胞内吞相关途径的抑制剂作用poly-PR多肽处理的神经元,我们发现只有网格蛋白依赖型细胞内吞的抑制剂chlorpromazine可以明显阻断poly-PR进入神经元。同时利用RNAi敲减网格蛋白重链蛋白(CLTC)也能阻断poly-PR进入神经元,进一步提示poly-PR是通过网格蛋白依赖型细胞内吞方式进入神经元。我们发现poly-PR进入神经元后引起SH-SY5Y细胞和小鼠原代皮层神经元的内质网应激,导致JNK活化以及促凋亡因子的激活,这些通路的激活最终导致了神经元的死亡。为了更好的模拟疾病相关状态,我们利用表达PR28的慢病毒载体去感染原代皮层神经元,结果同样显示表达PR28的小鼠原代皮层神经元也表现出内质网应激和促凋亡因子的激活。使用JNK抑制剂SP600125可以明显抑制poly-PR导致的神经元JNK激活,从而下调促凋亡因子p53和Bax的激活。使用网格蛋白依赖型内吞的抑制剂chlorpromazine可以明显阻断PR20导致的内质网应激和JNK活化,从而抑制促凋亡因子p53和Bax的激活。结论:Poly-PR通过网格蛋白依赖型细胞内吞的方式进入神经元,造成了神经元的内质网应激和JNK的活化,导致了神经元的死亡。利用JNK抑制剂SP600125和网格蛋白依赖型细胞内吞抑制剂chlorpromazine可以阻断poly-PR导致的神经元死亡。