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蛋白质一级结构决定高级结构。因此,同一蛋白酶应具有单一pI,而具有相似的氨基酸序列的不同的蛋白酶,也应该具有相似的pI。但许多蛋白酶,如乙醇酸氧化酶(GO)和1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)的pI是个范围；茎菠萝酶和果菠萝酶氨基酸序列高度同源,但两者p1分别是大于10.0和4.6。碱性的胰蛋白酶原切下Val-(Asp)4-Lys酸性六肽后,形成有活性的胰蛋白酶却是酸性的,其pI为4.1到5.89的范围。
GO亚基分子量为从38kDa到49kDa的一个范围；胰蛋白酶原的分子量为24kDa,胰蛋白酶存在23.3kDa(β型单体)和47kDa(α型二聚体)两种类型,但其分子量也是从24kDa到36kDa的一个范围。
我们发现,多个约2kDa的富含苯丙氨酸的碱性短肽(BOP:basicphenylalanine-rich oligo-peptide)以离子键和疏水相互作用,包裹在酸性的乙醇酸氧化酶(GO)表面,形成碱性的GO-BOP复合体(GC)。GC在IEF和2-DE中,BOP和GC出现不同程度的解离,导致GC出现10.0-3.25的多个等电点。
我们还发现,BOP也和Rubisco相结合,组成不同Rubisco-BOP复合体(RC)。以上两种蛋白-BOP复合体(GC和RC)在SDS-PAGE中,有时一个分子BOP和蛋白亚基如GO亚基以及rbs L/rbs S相结合并形成亚基-BOP复合体,如GO亚基-BOP,以及rbs L-BOP/rbs S-BOP。由于BOP很小,亚基-BOP复合体的大小和单独的亚基相差不大,但不同亚基-BOP复合体却因BOP而产生免疫交叉反应。有时数量不等的BOP与蛋GO亚基相结合,导致所形成的亚基-BOP复合体在SDS-PAGE中出现68kDa、64kDa、60kDa等条带。
为进一步证实,在SDS-PAGE中蛋白亚基和不同比例的BOP相结合,形成不同大小的亚基-BOP复合体。另外,菠萝酶和胰蛋白酶原等可能也和BOP结合,导致酶原为酸性看,但被碱性BOP包裹后为碱性。为此,本论文以提取的GC、高pI的RC、果菠萝酶以及胰蛋白酶为材料,反复进行SDS-PAGE及westernblot。研究发现:
1、对多批次提取获得的不同GC进行SDS-PAGE,大部分情况下都只出现40kDa的条带,但用GC抗体进行SDS-PAGE western blot可以识别除40kDa外的其他相对微弱条带。少数情况下GC在SDS—PAGE中出现40kDa条带以及另外一条略大于40kDa的条带,分子量分别是43、45和47kDa。
2、在提取纯化GO的过程中Rubisco可以和GO在DEAE Cellucose-52柱层析中一起被洗脱下来,在SDS-PAGE中分别形成40kDa的GC和68kDa的RC。但放置一段时间后再进行SDS-PAGE,68kDa条带消失,取代的是54kDa和14kDa的条带。根据本实验组之前报道,54kDa和14kDa条带很可能分别是rbsL-BOP和rbs S-BOP。用GC抗体对放置后的蛋白酶液进行SDS-PAGE westernblot,可以识别到54kDa和14kDa的条带。初步证实68kDa的RC是54kDa的rbs L和14kDa的rbs S在BOP的介导下聚合而成。
3、提取到的25kDa果菠萝酶放置一段时间后在SDS-PAGE中出现除25kDa菠萝蛋白酶亚基外的38kDa条带。用茎菠萝酶全酶抗体可以识别到菜心绿叶粗蛋白中的rbs L-BOP和果菠萝酶,因此放置后出现的的38kDa条带很可能是25kDa菠萝酶亚基与BOP形成的复合体。
4、胰蛋白酶在SDS-PAGE中除了出现其亚基23.3kDa条带和其二聚体47kDa条带外,还出现了分子量介于这两条带之间的条带。分别用rbs L—BOP抗体和rbsS-BOP抗体进行免疫印迹,结果都可以识别到这些条带,说明胰蛋白酶可能也含有BOP并与其形成蛋白亚基-BOP复合体。