目的:1.构建用于检测产气荚膜梭菌的毒素基因的压电石英晶体传感器系统软、硬件和针对检测研究的三种产气荚膜梭菌毒素基因的基因芯片。2.用多重PCR的方法对检测的三种产气荚膜毒素基因的特异序列进行扩增,用构建的压电石英晶体传感器产气荚膜梭菌基因芯片检测系统完成对产气荚膜梭菌的检测和其三种毒素基因的检测分型,并优化检测的反应条件。方法:1.在前期研究的基础上构建压电石英晶体传感器系统的结构和电路。运用精细微加工技术制作压电石英传感器和2×5型传感器矩阵单元。接入开发研制的温度控制单元,满足分子生物学反应的温度要求。使用新的频率计数卡和USB传输方式,提高仪器的适用性。在PESA V2.0版频率记录分析软件的基础上开发压电生物传感器PESA-4.0软件,完善软件功能及软件的易用性。2.采用10MHz的AT切型的石英晶体,采用离子溅射的方法镀上金膜,并且在石英晶体的定向精度控制、抛光精度控制、增加电极附着力、金膜电极尺寸以及金膜厚度等生产工艺上进行优化。运用Array Designer V2.0,Fast PCR V3.6.5, Primer Premier V5.0, Oligonucleotide Properties Calculator四种核酸分析和设计软件,自行设计三种寡核苷酸探针,5’端巯基修饰。利用巯基自组装的方法构建检测三种产气荚膜梭菌毒素基因的基因芯片。3.使用试剂盒和加酶孵育后煮沸两种方法提取产气荚膜梭菌基因组。根据GeneBank中已经发表的产气荚膜梭菌毒素基因序列,运用Array Designer V2.0,Fast PCR V3.6.5,Primer Premier V5.0, Oligonucleotide Properties Calculator四种核酸分析和设计软件,设计三对用在多重PCR反应体系中的产气荚膜梭菌α毒素、β毒素和肠毒素基因特异性引物。研究产气荚膜梭菌多重PCR反应体系,扩增基因检测的目的DNA序列,对反应体系进行优化,并用模拟标本和混合标本对反应体系可靠性进行验证。4.运用构建的压电石英晶体传感器产气荚膜梭菌基因芯片检测系统检测扩增得到的目的DNA序列,并对反应条件:PH值,离子强度、反应温度进行优化研究。运用优化后的反应条件对产气荚膜梭菌模拟标本进行检测。结果:1.成功构建新型的压电石英晶体传感器检测系统和产气荚膜梭菌基因芯片。检测系统外形美观、结实耐用,操作方便,布置便利。温度控制单元有效可控温度范围20~70摄氏度,精度为±0.5摄氏度,从20℃到70℃时,平衡时间≤45分钟。检测系统和基因芯片性能稳定,在气相中检测波动值≤±2Hz,2小时频率漂移≤±5Hz,在液相中波动值≤±5Hz,2小时频率漂移≤±10Hz,可以满足基因检测的需要。2.编程的压电生物传感器分析系统PESA-4.0软件正常运行在windows操作系统中,界面友好,各个功能较完善且直观易用,各个窗口布置合理且各项数据图像显示清晰,能够满足压电石英晶体传感器产气荚膜梭菌基因芯片检测系统的使用要求。3.多重PCR扩增模拟标本和混合标本所得DNA序列经电泳鉴定,序列大小为120bp、291bp、220bp,与预期序列大小一致。说明该多重PCR体系设计成功,能够适应检测工作的需要。同时,使用两种方法提取得到的基因模板扩增结果一致性好,选择加酶煮沸的方法更加简便快捷和廉价。4.运用构建的压电石英晶体传感器产气荚膜梭菌基因芯片检测系统检测产气荚膜梭菌,最佳PH值为7.6,最佳离子强度为0.64mol/L的Na离子,最佳的反应温度为37℃。在最适反应条件下检测频率有明显下降,三种基因芯片检测的频率下降大小与其检测的目的DNA序列大小一致。并且基因芯片的检测结果与空白对照差异显著,其频率变化值远大于空白对照组最大频率变化值的2倍。说明三种基因芯片功能正常,压电石英晶体检测系统能够有效检测出产气荚膜梭菌,并能分型鉴定三种不同的毒素。结论:1.构建的压电石英晶体传感器检测系统和产气荚膜梭菌基因芯片硬件设计较完善,工作稳定,计数电路计数准确;软件稳定易用,功能较完善,整个检测系统可以应用于检测和研究。2.多重PCR体系设计合理,扩增效率高,扩增结果符合设计目的。3.加酶孵育后煮沸提取产气荚膜梭菌基因组的方法可行,简便和廉价。4.构建的压电石英晶体传感器产气荚膜梭菌基因芯片检测系统能够有效检测产气荚膜梭菌的毒素基因并能用设计的三种基因芯片特异的分型鉴定三种产气荚膜梭菌毒素。