论文部分内容阅读
以烟草青枯病病原菌-青枯假单胞菌为靶标菌，利用平板对峙法，筛选获得2株具有较强且稳定拮抗能力的拮抗菌，编号分别为MTQ3、FGQ5。以16S rRNA基因分子鉴定方法为主要依据，结合菌株的形态、生理生化特征对拮抗菌株进行鉴定。经鉴定，MTQ3为Delftia tsuruhatensis，FGQ5为食酸代尔夫特菌Delftia acidovorans，将16S rRNA基因序列提交GenBank，登录号为MTQ3：HQ327477，FGQ5：HQ327476。用抗生素梯度平板法，对MTQ3和FGQ5进行药敏试验。结果表明，MTQ3、FGQ5均为卡那霉素敏感，能耐受10μg/mL的利福平。分别以MTQ3、FGQ5为受体菌，以E.coliDH5α（pRL1063a）为供体菌，E.coli DH5α（pRK2013）为辅助菌，进行三亲本杂交，得到8896个接合子，建立了Tn5随机插入突变库。采用影印法对突变株进行拮抗性能检测，从MTQ3的突变库中筛选到23个抑菌圈变大的突变株，4个抑菌圈变小的突变株，1个拮抗能力完全消失的突变株(MTQ3-ΔT)；从FGQ5的突变库中筛选到12个抑菌圈变大的突变株，5个抑菌圈变小的突变株。根据转座子Tn5-1063上的luxA序列设计引物，以转座子插入突变株总DNA为模板，PCR扩增luxA序列。结果证实，Tn5-1063插入到拮抗菌基因组中。对MTQ3-ΔT进行16S rDNA测序验证，其序列与MTQ3的16SrDNA序列完全一致。从Tn5-1063左末端向上游设计3个嵌套引物，同时设计了7个随机兼并引物，用TAIL-PCR（Thermal asymmetric inter laced PCR）方法，从突变株MTQ3-ΔT中克隆获得了转座子左侧翼序列，经比对为tetR基因的下游序列。以得到的序列设计特异性引物，继续进行TAIL-PCR扩增，拼接得到1492bp的片段，包含tetR基因的完整序列。将序列提交GenBank，获得登录号JQ425693。本实验所得到的tetR基因全长666bp，产物为含有223个氨基酸的TetR蛋白，属于转录调控TetR家族。其与已知基因组全序列的Delftia acidovorans SPH-1及Delftia sp. Cs1-4中tetR基因的相似性均为93%，蛋白序列相似性分别为95%和96%。为了验证tetR基因对MTQ3拮抗作用的影响，本工作构建了tetR的互补菌株。选择具有四环素抗性的pBR322质粒作为载体，克隆包含完整tetR基因及其启动子区的1278bp片段，构建了重组质粒pBR322-T。通过三亲本杂交，分别将pBR322和pBR322-T导入突变株MTQ3-ΔT，获得重组菌株MTQ3-ΔT-P和MTQ3-T。采用对峙平板法，检测MTQ3、MTQ3-ΔT、MTQ3-ΔT-P及MTQ3-T的拮抗能力，进行基因功能互补验证。结果表明，MTQ3-T完全恢复了拮抗能力，证实了tetR基因与MTQ3的拮抗性能有关。虽然Delftia acidovorans SPH-1及Delftia sp. Cs1-4的全基因组已经测序，但尚不清楚它们对病原菌的拮抗分子机制。本研究结果为进一步阐明代尔夫特菌的拮抗分子机制奠定了良好基础。