[目的]1、了解云南昆明地区下呼吸道感染患儿人鼻病毒（Human Rhinovirus,HRV）的血清型分布及其流行病学特征,为该地区儿童呼吸道感染病原学监测、防控策略的制定与实施提供参考。2、本研究对临床痰液样本中的HRV进行分离培养,获取毒种,并采用多种细胞进行分离株适应性传代培养,筛选出敏感细胞。为今后实验室分离HRV,以及相关疫苗的研究发展提供参考。[方法]1、本研究以2018年10月至2021年12月在昆明市儿童医院住院的下呼吸道感染患儿为研究对象。收集在此期间参与HRV核酸检测项目患者的病历信息以及核酸检测结果,并进行统计分析。2、于2019年09月-2021年12月期间,收集昆明市儿童医院HRV核酸检测结果为阳性的痰液样本（来自下呼吸道感染住院患儿）,共计217份。样本保存于-80℃冰箱。通过逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR,RT-PCR）对痰液样本中的HRV进行检测分型,PCR 阳性产物送昆明擎科生物公司测序。测序结果在NCBI数据库中通过BLAST比对分析进行初步物种鉴定,然后通过系统发育分析进行最终确认。分型结果结合相关患儿的病历资料,采用SPSS25软件进行统计分析。3、通过RT-PCR分段测序获得HRV-A11临床株的全基因组序列,然后从GenBank数据库中获得HRV-A11参考序列;采用MEGA5.0软件构建系统发育树;使用SimPlot软件对临床株进行同源重组分析;使用BioEdit7.09软件对临床株的氨基酸突变进行比较分析。4、于2021年03月-2021年12月期间,在昆明市儿童医院呼吸内科采集到108例下呼吸道感染住院患儿痰液样本,并采用了 H1-Hela细胞对样本中的毒株进行分离培养,随后通过空斑纯化获取克隆纯化好的病毒分离株。继续将纯化好的分离株接种到状态良好的KMB17、RD、Vero以及Hep-2细胞上,进行细胞适应性传代培养。5、采用5’UTR通用引物以及VP1特异性引物对纯化后的分离株和细胞适应株进行物种鉴定,并通过透射电子显微镜技术和间接免疫荧光技术来佐证鉴定结果。接着对适应株进行病毒感染性滴度TCID50的测定并绘制一步生长曲线,以及噬斑实验,来初步探究适应株的部分生物学特性。6、通过RT-PCR分段测序获得适应株的全基因组序列,然后从GenBank数据库中获得参考序列;采用MEGA5.0软件构建系统发育树;使用SimPlot软件对分离株进行同源重组分析;使用BioEdit 7.09软件对分离株的氨基酸突变进行比较分析。[结果]1、2018年10月-2021年12月期间,昆明市儿童医院参与HRV核酸检测项目的总人次共计3349人次。HRV检出率分别为2018年14.85%（15/101）,2019年 16.29%（235/1443）,2020 年 14.89%（95/638）,2021 年 15.85%（185/1167）,4年平均检出率为15.47%。HRV全年都有检出,高峰主要集中在7-11月份。阳性样本中男女性别比约为1.8:1（340:190）,0-1岁年龄段的男童占比最高,为26.79%（142/530）。其次为0-1岁的女童,占比14.34%（76/530）。HRV核酸阳性的患儿主要集中在6岁以内。HRV核酸阳性患儿的临床诊断主要以支气管肺炎74.91%（397/530）为主。2、本研究收集到的217份HRV核酸阳性痰液样本中,有84例阳性样本定型成功。其中 HRV-A 组占比 69%（58/84）;HRV-B 组占比 2%（2/84）;以及 HRV-C组占比29%（24/84）。其中HRV-A11和HRV-A12血清型数量最多,均为7例。HRV-A和HRV-C组感染相关的主要症状为咳嗽。HRV感染的患儿的临床诊断主要以支气管肺炎为主。在混合感染情况下,以HRV混合肺炎支原体、或EB病毒、或肺炎链球菌等较为常见。3、通过全基因组测序获得3株HRV-A11株全基因序列。分别命名为KM50、KM55和KM61。其与美国的XHZLKL、R3TYRP和WNJ7NJ毒株的亲缘性最近。三株HRV-A11临床株未发生同源重组。在三株HRV-A11临床株的P1a表位中,天冬酰胺被转变为天冬氨酸,异亮氨酸被转变为缬氨酸,丝氨酸被转变为甘氨酸,缬氨酸被转变为异亮氨酸,谷氨酰胺被转变为赖氨酸。4、本研究采用H1-Hela细胞进行病毒分离培养,成功获得2株病毒分离株HS017和HS021。将通过空斑纯化好的分离株接种到KMB17、RD、Vero以及Hep-2细胞上,结果只得到KMB17细胞适应毒株YN017与YN021。5、系统发育分析结果表明YN017与YN021株均属HRV-A16血清型。通过透射电镜可以观察到数个直径约30nm、无包膜、近似圆球形的病毒颗粒。适应株间接免疫荧光结果为阳性,提示YN017与YN021株均为HRV。适应株在KMB17细胞中稳定增殖,感染性滴度峰值分别为6.5833 1gTCIDs0/mL和6.5417 1gTCID50/mL。在病毒噬斑实验中,肉眼可见多个浅色斑块,形状有的近似圆形,有的边缘不规则。6、2株适应株与登录号为MH685687的参考株亲缘关系最近,分别为96.11%与96.05%,而与原型株（登录号为L24917）同源性分别为90.22%,与90.13%。2株适应株均未出现明显的同源重组。与原型株相比较,核苷酸突变数量分别为631个与667个,氨基酸突变数量分别为45个与50个。在本研究中2株分离株的RVA57-74表位中,第72位的苏氨酸转化为丝氨酸。在RVA97-114表位中,第114位谷氨酸转化为谷氨酰胺。[结论]1、在昆明市儿童医院下呼吸道感染住院患儿中HRV的检出率为15.47%,全年流行,流行高峰期为秋季,学龄前儿童为HRV易感人群,发病症状以咳嗽为主,诊断多为支气管肺炎。2、本研究中,HRV-A11、HRV-A12、HRV-A101和HRV-C45这四类血清型检出数量位居前四位。3、本研究获得3株中国境内流行的HRV-A11毒株的完整基因组序列,并发现VP1衣壳蛋白区P1a细胞表位有5处突变,可能会对病毒毒力造成影响。4、本研究获得了 2株HRV-A16分离株,并且其能够在KMB17细胞中稳定增殖,可以作为候选疫苗株,用于疫苗的研发。