论文部分内容阅读
目的:通过四氯化碳诱导肝硬化大鼠模型,观察中药毒消肝清丸对实验性肝硬化大鼠肠道组织细胞凋亡和PI3K、p-Akt、NF-kB、IkB蛋白表达的影响,探讨毒消肝清丸对实验性肝硬化大鼠肠粘膜屏障功能障碍干预的作用机制。方法:将清洁级Wistar大鼠88只,适应环境饲养7天后随机分为6组,分别为正常组8只,模型组、对照组、毒消肝清丸高、中、低剂量组各16只。经给予50%四氯化碳溶剂大鼠大腿根部皮下注射,每次每只0.5 ml·100g-1,2次·wk-1,并根据体重变化调整剂量,共12周,成功制备肝硬化大鼠模型。造模成功后除空白组、模型组外,均给予相应药物灌服。空白组:同期相同条件下饲养,每日给予蒸馏水2ml/100g灌胃;模型组:同期相同条件下饲养,每日给予蒸馏水2ml/100g灌胃;高剂量组(223.4mg/kg):日一次灌胃给药,连续给药12周;中剂量组(111.7mg/kg):日一次灌胃给药,连续给药12周;低剂量组(58.9mg/kg):日一次灌胃给药,连续给药12周;乳果糖组(配置浓度100g/L,以1ml/100g灌胃):日一次灌胃给药,连续给药12周。结果:1、一般状态观察:毒消肝清丸各组和乳果糖组均较模型组有不同程度的改善,其中以中剂量组最为明显。中、高剂量组好于对照组,但较正常组仍有差距。大鼠死亡率也以毒消肝清丸中剂量组最低为31.25%,模型组50%,乳果糖组37.5%,毒消肝清丸低剂量组37.5%,毒消肝清丸低剂量组43.75%。2、毒消肝清丸对肝硬化大鼠肝组织病理形态学的影响:正常组表现为正常大鼠肝脏形态,结构完整、清晰,肝细胞排列成索状,可见中央静脉周围放射状分布,肝血窦清晰可见,肝小叶结构正常;模型组肝小叶结构消失,肝细胞体积增大,间质内可见淋巴细胞浸润,可见多核肝细胞,肝细胞脂肪变,有纤维组织增生并填充于肝细胞间,形成假小叶。低剂量组肝小叶结构破坏,有淋巴细胞、单核细胞的浸润,纤维组织增生,间隔的形成有所减少;中剂量组可见肝小叶结构的破坏,气泡样变性肝细胞、炎症细胞少,偶可见坏死细胞,可见纤维组织增生,间隔形成减少,好于模型组,但较正常组差;高剂量组介于低剂量和中剂量组镜下观察之间;乳果糖组与模型组相似。3、毒消肝清丸对肝硬化大鼠肠道组织病理形态学的影响:正常组表现为正常大鼠肠粘膜绒毛形态;模型组大鼠肠粘膜绒毛可见萎缩、缩短、断裂,甚至可见水肿,上皮下间隙增大,有炎症细胞浸润到粘膜固有层乃至肌层,上皮层和固有层有分离现象,粘膜层组织疏松;治疗组可见肠粘膜绒毛排列整齐,粘膜层变得紧致,上皮下间隙缩小,水肿减轻,同时炎症细胞数量减少,其中以中剂量组改善最为明显。乳果糖组也可见上述改善,但不甚明显。经评分后比较,毒消肝清丸低、中、高剂量组改善最为明显,优于对照组(p<0.05,p<0.01);乳果糖组与模型组比较无显著差异(p>0.05);模型组评分明显高于正常组(p<0.05);中剂量组评分仍高于正常组(p<0.01)。4、毒消肝清丸对肝硬化模型大鼠肠道组织pi3k/akt通路的影响:(1)免疫组化观察肠道组织中pi3k蛋白的表达:空白组未见pi3k蛋白的表达,毒消肝清丸低剂量组与模型组无差异;而毒消肝清丸中剂量组、高剂量组和乳果糖组肠道组织中pi3k蛋白的表达明显高于模型组(p<0.01);其中以毒消肝清丸中剂量组表达最为明显;乳果糖组和毒消肝清丸低剂量组表达含量相似(p<0.05);毒消肝清丸中、高剂量组表达高于乳果糖组(p<0.05或p<0.01)。(2)免疫组化观察肠道组织中p-akt蛋白的表达:空白组未见p-akt的表达,而毒消肝清丸低剂量组、高剂量组和乳果糖组肠道组织中p-akt的表达与模型组相比无差异;仅毒消肝清丸中剂量组表达明显高于模型组(p<0.01);乳果糖组和毒消肝清丸低剂量组、高剂量组表达含量相似(p<0.05),但明显低于毒消肝清丸中剂量组(p<0.01)。(3)westernblot检测pi3k、p-akt蛋白表达水平:pi3k蛋白含量:毒消肝清丸低剂量组和中剂量组肠道组织pi3k蛋白含量高于模型组(p<0.05或p<0.01);毒消肝清丸高剂量组和乳果糖组与模型组无差异;而毒消肝清丸中剂量组表达高于乳果糖组(p<0.01),而毒消肝清丸低、高剂量组与乳果糖组相似。p-akt蛋白含量:毒消肝清丸低、中剂量组和乳果糖组表达明显高于模型组(p<0.01);毒消肝清丸中剂量组表达高于乳果糖组(p<0.05),而毒消肝清丸高剂量组表达则低于乳果糖组(p<0.05)。5、毒消肝清丸对肝硬化模型大鼠肠道组织nf-kb信号通路的影响:(1)免疫组化观察肠道组织中nf-kb蛋白的表达:空白组未见nf-kb蛋白的表达,而毒消肝清丸低剂量组和高剂量组与模型组无差异(p>0.05);毒消肝清丸中剂量组和乳果糖组肠道组织中nf-kb蛋白的表达低于模型组(p<0.05或p>0.01),其中以毒消肝清丸中剂量组表达最为明显;毒消肝清丸中剂量组表达含量低于乳果糖组(p<0.05);毒消肝清丸低、高剂量组与乳果糖组相似。(2)免疫组化观察肠道组织中ikb蛋白的表达:空白组未见ikb蛋白的表达,毒消肝清丸低剂量组与模型组无差异;毒消肝清丸中剂量组、高剂量组和乳果糖组肠道组织中ikb蛋白的表达明显低于模型组(p<0.05或p<0.01),其中以毒消肝清丸中、高剂量组表达最为明显;毒消肝清丸中、高剂量组表达高于乳果糖组(P<0.05或P<0.01);毒消肝清丸低剂量组与乳果糖组相似。(3)Western blot检测NF-k B、Ik B蛋白表达水平:NF-kB蛋白含量:毒消肝清丸低、中、高剂量组肠道组织NF-k B蛋白含量高于模型组(P<0.01),而乳果糖组与模型组无差异;毒消肝清丸中剂量组表达高于乳果糖组(P<0.01),而毒消肝清丸低、高剂量组与乳果糖组相似。Ik B蛋白含量:毒消肝清丸低、中、高剂量组和乳果糖组表达明显高于模型组(P<0.05或P<0.01);毒消肝清丸中、高剂量组表达高于乳果糖组(P<0.01);毒消肝清丸低剂量组与乳果糖组相似。6、毒消肝清丸对肝硬化模型大鼠肠道组织细胞凋亡的影响:空白组未见凋亡细胞的表达,毒消肝清丸低、中、高剂量组和乳果糖组凋亡细胞数明显低于模型组(P<0.01);其中毒消肝清丸中剂量组又明显低于乳果糖组(P<0.01),其余各组与乳果糖组无差异。结论:1、毒消肝清丸具有改善肝硬化大鼠一般状态,维持肠粘膜组织形态结构完整性以及保护肝脏的作用。2、毒消肝清丸可能是通过上调PI3K/Akt信号通路,抑制肠粘膜细胞凋亡,保护肠粘膜屏障。3、毒消肝清丸可能是通过下调NF-kB信号通路,减轻肠道炎症损伤的作用,保护肠粘膜屏障。4、毒消肝清丸具有抗肠道组织细胞凋亡的作用,从而保护肠粘膜屏障。5、综合上述实验结果,依据中医下法创立的毒消肝清丸具有抗炎,抗凋亡作用,为解释其补气健脾、滋阴清热、泻毒导滞保护肝肠的作用,提供了理论与实验依据。