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研究目的模拟免疫性血小板减少症(ITP)患者所特有的被覆大量自身抗体的血小板作为长春新碱载药体,通过抗体介导的血小板载药体的吞噬,将长春新碱靶向运输至巨噬细胞内。观察载药体对巨噬细胞的杀伤作用,同时探讨其相关的分子机制及机理,为各种类型抗ITP药物的体内传递建立一种通用的靶向载体平台,同时也为建立临床ITP靶向治疗新策略提供理论和实验依据。研究方法以致敏血小板为载体制备长春新碱-血小板载药体,观察包载长春新碱后血小板形态的改变,检测载药后血小板的粒径、膜蛋白表达及凝集功能的变化,并根据载药率、包封率优化载药条件。通过检测佛波酯诱导后的THP-1细胞表达成熟巨噬细胞特异性分化抗原CD1 1b和CD14,以及分化后对鸡红细胞的吞噬能力,以明确THP-1细胞分化成熟为有强大吞噬功能的巨噬细胞。分化后的THP-1细胞分别与空白血小板(PLT组)、游离长春新碱(VCR组)、长春新碱-血小板载药体(VLP组)、长春新碱-致敏血小板载药体(CD41-VLP组)共培养,并设立阴性对照组(Control组)。高效液相色谱法(HPLC)检测各组THP-1巨噬细胞内VCR的浓度,CCK-8法检测以上各处理方式对THP-1细胞活力的抑制作用,并通过Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂检测THP-1细胞凋亡情况。免疫蛋白印迹法检测各处理组中THP-1细胞内凋亡相关蛋白(Bax、Caspase-3、CyclinB1、Bcl-2)的表达情况。研究结果(1)搭乘长春新碱的血小板载药体与正常血小板相比,并无无明显皱缩,血小板变性能力无明显减弱。血小板载体与空白血小板直径、膜蛋白(CD41、CD61、CD47)表达以及凝集功能无明显改变。(2)当投放长春新碱为160ug/ml时,药物的利用度及载药量均达最佳水平。CD41-VLP载药体在弱碱性溶液中,36小时内的药物释放率只有38.9%。而类似溶酶体的酸性环境中,即pH=5.0的缓冲液中释放迅速,6小时药物释率为33.7%,36小时的药物释率为77.6%。(3)加入100ng/ml PMA诱导分化48h后,THP-1细胞CD11b、CD14双阳性细胞为40.6%,明显高于24h(16.5%,P<0.01)。与20%的鸡红细胞悬液共孵育6小时吞噬百分率达91.8%,吞噬指数为251.7%,有强大的吞噬能力。(4)游离VCR组、VLP组、CD41-VLP组24h巨噬细胞内长春新碱的浓度均在投药量的10%左右,差异无统计学差异(P=0.218)。24h后游离VCR组、VLP 组细胞内药物增长缓慢,48h 为 14.15%±2.34%、17.29%±2.57%(P>0.05),72h 为 18.0%±1.87%、21.63%±2.17%(P>0.05)。但 CD41-VLP组较前述两组增长迅速(P<0.01),48h 为 23.49%±2.24%,72h 为 30.72%±3.11%。(5)空白血小板与THP-1细胞共培育24h、48h、72h对细胞增殖抑制作用小于10%。VCR组THP-1细胞的72h抑制率为47.87%±4.92%,VLP组为55.7%±3.02%,两组差异无统计学意义;CD41-VLP组72h抑制率为73.06±5.26%较前两组抑制作用明显(P<0.05)。搭乘长春新碱的VLP及CD41-VLP对正常骨髓细胞的活性抑制率小于10%,与阴性对照组相比无统计学差异;而游离VCR与骨髓细胞共培育72h后细胞活性抑制率高达37.81±3.91%,与前述载药体相比差异有统计学意义(P<0.01)。(6)诱导分化成为成熟巨噬细胞的THP-1同空白血小板共培育72小时,凋亡率与阴性对照组无明显差异(P>0.05)。游离VCR、VLP与THP-1细胞共培育72小时,凋亡率分别为44.4%±4.1%、54.55%±5.03%,差异无统计学差异(P>0.05)。CD41-VLP组凋亡率为69.7%±4.26%,较前述2组凋亡明显增加(P<0.01)。(7)阴性对照组与空白血小板组THP-1细胞内凋亡相关蛋白表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。游离VCR组、VLP组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达量较对照组和PLT组明显增加(P<0.01),但两组间差异无统计学意义(P 0.05)。CD41-VLP组Bax、Caspase-3、CyclinB1蛋白表达量在所有组中增加最为明显(P<0.01),Bcl-2蛋白表达下调也最为明显(P<0.01)。结论(1)长春新碱能有效的包载于血小板内,且不影响血小板基本形态及凝集功能。(2)长春新碱-致敏血小板载药体可被诱导后的THP-1细胞主动吞噬,高效的将长春新碱靶向运输至THP-1细胞内。(3)长春新碱-致敏血小板载药体可有效增强长春新碱对诱导后的THP-1细胞的抑制作用,通过上调THP-1巨噬细胞内的促凋亡蛋白Bax、Caspase3的表达,下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制CyclinB1的降解,导致THP-1巨噬细胞凋亡。