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研究背景和目的:病理性心肌肥厚是高血压、急性心肌梗死以及多种先天性心脏病等临床疾病的常见并发症,是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立的危险因素。一氧化氮(nitric oxide,NO)作为机体内重要的气体信号分子,对心血管的功能起着重要的调控作用,它可以通过调节蛋白质的巯基亚硝基化修饰(S-nitrosylation)来发挥生物学效应。线粒体损伤和能量代谢障碍是病理性心肌肥厚的重要原因,腺嘌呤核苷酸转运体(ANT)是一种位于线粒体内膜的跨膜蛋白,参与细胞质与线粒体基质ADP/ATP的转运,偶联细胞的产能和耗能,在调控心肌细胞能量转化过程中发挥着重要的作用。然而,在病理性心肌肥厚时,ANT1是否能发生巯基亚硝基化修饰,以及ANT1的巯基亚硝基化修饰在病理性心肌肥厚中的作用及机制目前尚不清楚。本研究主要的研究目的是利用AngⅡ诱导心肌细胞肥大的细胞模型以及TAC术后小鼠心脏肥大模型,来探讨心肌肥大时ANT1是否发生巯基亚硝基化修饰,并探讨ANT1蛋白的巯基亚硝基化修饰在心肌肥厚中的作用与机制。实验方法和结果:用Biotin-switch的方法对自发性高血压大鼠(SHR)及其对照组(WKY)大鼠心肌组织、胸主动脉缩窄术(TAC)后小鼠心肌组织、AngⅡ刺激后的SD乳大鼠原代心肌细胞中,ANT1的巯基亚硝基化修饰水平进行检测。结果表明:在自发性高血压SHR大鼠及TAC动物肥厚模型中,以及AngⅡ致心肌细胞肥厚模型中,ANT1的巯基亚硝基化修饰水平明显增加。利用基质辅助电离激光解吸-飞行时间-串联二级质谱(MALDI-TOF-MS/MS)技术筛选出ANT1发生亚硝基化修饰的确切半胱氨酸位点;并进一步将ANT1的半胱氨酸突变成丙氨酸,构建ANT1特异性半胱氨酸位点突变的质粒,转染293细胞,并利用Biotin-switch结合western-blot技术,再次验证ANT1发生疏基亚硝基化修饰的位点。结果发现:ANT1蛋白的半胱氨酸160位点发生了巯基亚硝基化修饰。构建ANT1半胱氨酸160位点突变(Ad-C160A)腺病毒、野生型(Ad-WT)及对照组腺病毒(Ad-GFP),感染原代SD乳大鼠心肌细胞,给予AngⅡ刺激,检测肥厚相关基因ANP和BNP的mRNA表达水平,并通过α-actinin标记心肌细胞表面积,来检测心肌细胞肥大程度。结果显示:将半胱氨酸160位点突变后,可以明显改善由AngⅡ介导的心肌细胞肥厚程度。将上述ANT1腺病毒,感染原代SD乳大鼠心肌细胞,给予AngⅡ刺激,用Seahorse生物能量测定仪测定细胞氧耗率(oxygen consumption rate,OCR)、MitoSox荧光染色检测线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、MitoCMX Ros染色检测线粒体膜电位(△ψm)的变化。结果显示:AngⅡ诱导的肥厚心肌细胞中,线粒体呼吸能力显著降低,线粒体活性氧的产生增加,线粒体膜电势降低;但Cys160位点突变后,线粒体呼吸能力恢复,活性氧产生减少,线粒体膜电势降低程度减轻,即能够对抗AngⅡ致心肌肥厚的作用。在致肥厚因子的刺激下,亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosogluthathione reductase,GSNOR)的表达水平降低。过表达GSNOR以后,再分别给予AngⅡ刺激及TAC处理,分别利用Biotin-switch结合western-blot技术,检测ANT1发生巯基亚硝基化修饰的水平变化及肥厚程度。结果发现:过表达GSNOR以后,ANT1发生巯基亚硝基化修饰的水平降低,心脏肥厚程度降低。结论:以上结果表明在AngⅡ刺激和TAC术后的病理性心肌肥厚中,ANT1在半胱氨酸160位发生巯基亚硝基化修饰,降低了线粒体呼吸能力,造成线粒体活性氧的产生增加,线粒体膜电势降低,导致线粒体功能紊乱,最终促进心肌肥大。而GSNOR在病理性心肌肥厚中ANT1的巯基亚硝基化修饰起到重要调控作用,过表达GSNOR能够降低ANT1的巯基亚硝基化修饰水平,并对抗心肌肥厚。