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目的:非整倍体指细胞内染色体数目出现异常,有丝分裂过程中纺锤体检验点功能失调等都可导致非整倍体的产生。大多数肿瘤中都存在非整倍体现象。临床上非整倍体程度高的肿瘤预后较差。研究表明非整倍体肿瘤细胞对常规化疗药物如顺铂、奥沙利铂和羟基脲等具有耐药性。因此,探讨更多种类化疗药物对非整倍体肿瘤细胞的作用情况对临床肿瘤治疗具有重要的意义。哌立福新(Perifosine)是目前处于临床试验阶段的一种蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB,通称AKT)抑制剂,其可以通过抑制AKT活性增加抑癌基因p53的表达,进而抑制肿瘤细胞增殖。哌立福新对不同核型肿瘤细胞的作用差异以及相关机制目前尚缺乏研究。本文以结肠癌为研究对象,通过在整倍体结肠癌细胞的基础上构建非整倍体模型,研究整倍体和非整倍体结肠癌细胞对哌立福新的耐药性差异,并进一步对其机制进行初步探讨。方法:(1)通过pT3G-MAD2慢病毒表达质粒构建HCT116-MAD2细胞系,该细胞系经盐酸强力霉素(Doxycycline,Dox)处理可以激活tet-on系统使细胞短时表达MAD2 shRNA以敲低纺锤体检验点关键蛋白MAD2表达,进而干扰纺锤体检验点正常功能、诱导非整倍体产生(Dox(+)细胞),未经Dox处理的即为整倍体对照组(Dox(-))细胞。采用荧光显微镜观察细胞荧光情况确定MAD2 shRNA的表达;通过免疫印迹(Western blot)方法检测细胞中MAD2蛋白表达情况;通过染色体滴定实验检测整倍体Dox(-)和非整倍体Dox(+)细胞的核型。(2)通过细胞计数和CCK-8实验检测使用不同浓度哌立福新处理整倍体Dox(-)和非整倍体Dox(+)细胞48小时后细胞的生长情况;通过细胞计数实验检测使用相同浓度哌立福新处理整倍体Dox(-)和非整倍体Dox(+)细胞24、48和72小时后细胞的生长情况;通过Western blot实验检测哌立福新处理48小时后细胞内凋亡标志分子cleaved-PARP和cleaved-Caspase 3的表达情况,分析整倍体和非整倍体HCT116-MAD2细胞对哌立福新的耐药性差异。(3)使用Western blot方法检测经哌立福新处理48小时后整倍体Dox(-)和非整倍体Dox(+)细胞中总AKT、磷酸化AKT以及p53蛋白的表达情况,分析药物处理前后整倍体和非整倍体结肠癌细胞中AKT-p53通路的激活差异。(4)通过荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测哌立福新处理后p53下游凋亡相关基因BAX、PUMA和NOXA的mRNA表达情况;采用Western blot实验检测PUMA和BAX的蛋白表达情况,分析比较两种核型结肠癌细胞中哌立福新处理后p53下游通路的激活情况。(5)为分析AKT表达对整倍体和非整倍体结肠癌细胞的影响,通过慢病毒质粒(分别使用两种不同序列的shRNA)稳定敲低HCT116-MAD2细胞系中AKT的表达,构建HCT116-MAD2-AKT-1、HCT116-MAD2-AKT-2细胞系以及对照组HCT116-MAD2-Con细胞系。通过Western blot方法检测AKT敲低情况。通过Dox诱导非整倍体产生,使用染色体滴定方法分析Control shRNA Dox(-)、Control shRNA Dox(+)、shRNA AKT1 Dox(-)、shRNA AKT1 Dox(+)、shRNA AKT2 Dox(-)和shRNA AKT2 Dox(+)六组细胞的核型。通过细胞计数方法比较上述六组细胞的生长情况;通过qRT-PCR和Western blot方法分析AKT敲低后整倍体和非整倍体细胞的凋亡和AKT-p53通路分子激活情况。结果:(1)使用Dox处理HCT116-MAD2细胞12小时后撤药,第3天可以观察到非整倍体Dox(+)细胞有红色荧光,提示细胞中MAD2 shRNA的表达,第6天时红色荧光强度减弱,整倍体Dox(-)细胞在实验过程中未观察到红色荧光。第3天时非整倍体Dox(+)细胞相较整倍体Dox(-)细胞MAD2表达显著降低,第6天Dox(+)细胞中MAD2表达恢复正常。染色体滴定实验表明Dox(+)细胞的非整倍体比率为90%,而Dox(-)细胞中非整倍体比率仅为14%。(2)经不同浓度的哌立福新处理不同时间后,非整倍体Dox(+)细胞的生长活性显著高于整倍体Dox(-)细胞;加药后两组细胞中细胞凋亡标志分子cleaved-PARP和cleaved-Caspase 3的表达均上升,但整倍体细胞中cleaved-PARP和cleaved-Caspase 3上升程度显著高于非整倍体细胞。(3)哌立福新处理后,整倍体Dox(-)细胞和非整倍体Dox(+)细胞中磷酸化AKT(S473)表达均下降、p53表达均上升;相较Dox(-)细胞,药物处理后Dox(+)细胞中p53的上升程度较低。(4)哌立福新处理后,非整倍体Dox(+)细胞中p53蛋白下游靶基因BAX、PUMA和NOXA的mRNA表达水平以及PUMA和BAX的蛋白表达水平上升程度均较整倍体Dox(-)细胞显著降低。(5)使用 Dox 处理 HCT116-MAD2-Con、HCT116-MAD2-AKT-1 和 HCT116-MAD2-AKT-2细胞诱导非整倍体产生。染色体滴定实验表明Control shRNA Dox(-)、Control shRNA Dox(+)、shRNA AKT1 Dox(-)、shRNA AKTl Dox(+)、shRNA AKT2 Dox(-)和shRNA AKT2 Dox(+)六组细胞的非整倍体比率分别为13%、90%、10%、87%、13%和87%。相较整倍体结肠癌细胞,AKT敲低后非整倍体结肠癌细胞生长活性的下降程度和细胞中凋亡标志分子cleaved-PARP的表达上升程度均显著下降;细胞中p53蛋白的上升程度、p53下游基因BAX和PUMA的mRNA表达上调水平显著降低。结论:(1)通过tet-on系统短时诱导MAD2 shRNA表达干扰纺锤体检验点功能,可以建立一个以非整倍体为主要异常的结肠癌模型。(2)相较整倍体Dox(-)细胞,非整倍体Dox(+)细胞对哌立福新具有耐药性。(3)整倍体Dox(-)和非整倍体Dox(+)细胞对哌立福新的耐药性差异与细胞中p53通路激活水平相关,AKT对非整倍体结肠癌细胞生长活性的影响与整倍体结肠癌细胞相比较小。