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【目的】 1．通过对MaltOR14、MaltOR15、MaltOR17、MaltOR19、MaltOR45和MaltORCO的序列分析，构建进化树，为后续解析以上6种气味受体膜蛋白基因的功能特性提供基础。 2．RT-qPCR检测OR在松墨天牛蛹和成虫期不同组织的表达水平，得到组织表达谱用于推断OR基因在松墨天牛生命周期中发挥的功能。 3．对MaltOR15和MaltOR45基因构建爪蟾表达载体，利用爪蟾卵进行MaltOR15/MaltORco和MaltOR45/MaltORco的表达，结合双电极电压钳技术，研究气味受体蛋白在松墨天牛生命周期中发挥的功能。 【方法】 1．松墨天牛MaltOR14、MaltOR15、MaltOR17、MaltOR19、MaltOR45和MaltORCO基因的序列分析 利用前期转录组测序得到的基因序列片段，根据片段利用软件primer5.0设计MaltOR14、MaltOR15、MaltOR17、MaltOR19、MaltOR45和MaltORCO的ORF区域引物，进一步通过相应分子生物学技术获得6个目的基因的全长，利用软件Lasergene对MaltOR14、MaltOR15、MaltOR17、MaltOR19、MaltOR45和MaltORCO基因编码的氨基酸序列进行预测，并利用软件Clustal对得到的氨基酸序列进行比对，使用Mega6.0软件进行系统发育树的构建。 2．松墨天牛OR基因在蛹和成虫期表达谱研究 提取松墨天牛雄蛹的触角、下唇须、胸、腹部末端、足、性腺；雄性成虫的触角、下唇须、胸、腹部末端、足、性腺；雌性成虫的触角，分别提取以上组织的总RNA，逆转录cDNA，并设计用于RT-qPCR检测OR基因的引物，以及两对内参引物，最后对荧光定量pcr结果进行显著性分析。 3．松墨天牛MaltOR15和MaltOR45基因的功能研究 (1)构建MaltOR15和MaltOR45的表达载体。 (2)体外RNA合成。 (3)显微注射于非洲爪蟾卵母细胞并表达蛋白。 (4)双电极电压钳记录，植物气味刺激，电压钳记录生物电活动。 【结果】 1．序列分析结果：首次成功构建MaltOR14，MaltOR15，MaltOR17，MaltOR19，MaltOR45和MaltORCO这6个基因的克隆载体。MaltOR14，MaltOR15，MaltOR17，MaltOR19，MaltOR45的基因序列在NCBI的基因库中并不存在，为本研究首次克隆到的基因；虽然MaltORCO的基因序列已经在NCBI的基因库中存在，但是本研究得到MaltORCO的基因序列达到1434bp，长于NCBI基因库中已经登录的MaltORCO（1356bp）。（MaltOR14、MaltOR15、MaltOR17、MaltOR19、MaltOR45和MaltORCO，ORF长度分别为1209bp、1212bp、960bp、1119bp、1131bp和1434bp，分别编码402、403、319、372、376和477个氨基酸。） MaltORs的氨基酸序列比对结果显示，6个嗅觉受体相似性很低。差异很大，相同氨基酸只有6个，其中5’端无相同氨基酸，3’端有3个相同氨基酸，保守性比5’端强。各MaltORs的氨基酸组成也存在差异，其中缬氨酸（Val）在六个MaltOR中含量最高，差异最小，而组氨酸（His）在六个MaltORs中的差异最大。 氨基酸序列进行跨膜结果预测，发现6个嗅觉受体蛋白并非都是七跨膜蛋白，但可能是由于跨膜结构域预测的不准确性造成的，6个嗅觉受体蛋白在细胞膜上内外的氨基酸排列顺序也各有差异。 在系统发育分析中，鞘翅目嗅觉受体分为6个群，MaltOR14、MaltOR15、MaltOR17、MaltOR19、MaltOR45、MaltORco分别归属于其中5个群，其中MaltOR14与AglaOR1，MaltOR19与AglaOR71，MaltOR15与AglaOR2和OR3聚成一个分支，表明MaltOR14与AglaOR1，MaltOR19与AglaOR71，MaltOR15与AglaOR2和AglaOR3具有同源性。MaltOR17和MaltOR45并没有和光肩星天牛的基因聚成一个分支，表明MaltOR17和MaltOR45在光肩星天牛中无同源基因，这可能就是松墨天牛用于区别裸子植物气味和被子植物气味的嗅觉受体。 2．组织和发育表达谱结果：两个内参基因（GAPDH和TUB）的结果综合比较，在松墨天牛雄性成虫的各个组织间,MaltOR14在松墨天牛雄性成虫的足中表达高于其他组织；MaltOR15在松墨天牛雄性成虫的胸中表达高于其他组织，下唇须中低于其他组织；MaltOR17在雄性松墨天牛成虫性腺中表达水平高于其他组织；MaltOR19在松墨天牛雄性成虫足中表达高于其他组织，在腹中相对其他较低；MaltOR45在松墨天牛雄性成虫的触角和腹中比其他组织表达低；MaltORCO作为共受体在雄性松墨天牛的胸和足中表达高，在腹中表达最低。 在松墨天牛蛹各组织中，MaltOR14在性腺中表达最低；MaltOR15在触角和腹中的表达高于其他组织；MaltOR17和MaltOR19在下唇须和腹中的表达量显著高于其他组织中的表达量；MaltOR45在胸和性腺中表达量最高；MaltORCO在下唇须中显著高于其他组织，在胸中表达最低。 在松墨天牛蛹、雄成虫和雌成虫触角中：MaltOR17和MaltOR19在雄性成虫触角的表达量显著高于蛹触角表达水平，MaltORCO在蛹的触角的表达量略高于雄性成虫触角，MaltOR15在雄性触角中高于蛹触角中表达水平，MaltOR45在蛹触角中的表达量显著高于雄性成虫触角，而MaltOR14在蛹和雄性成虫触角的表达量没有显著差异。MaltOR17和MaltOR19在雄性成虫触角的表达量显著高于雌性成虫触角，MaltORCO在雌性成虫触角的表达量略高于雄性成虫触角，MaltOR15和MaltOR45在雄性成虫触角中的表达量高于雌性成虫触角，而MaltOR14在雌雄成虫触角的表达量没有显著差异。 3．功能研究结果：本文成功构建了MaltORco，MaltOR15和MaltOR45的PGH19表达载体；利用体外合成试剂盒成功得到了MaltORco，MaltOR15和MaltOR45的cRNA；利用显微注射在爪蟾卵中成功表达了MaltORco，MaltOR15和MaltOR45蛋白；利用双电极电压钳技术成功鉴定出MaltOR45的识别配体气味包括长叶烯、月桂烯、苯甲酸丁酯、Hepetanal，但MaltOR15的识别配体气味没有找到。 【结论】 1．本实验首次得到了松墨天牛的6个OR家族基因MaltOR14、MaltOR15、MaltOR17、MaltOR19、MaltOR45和MaltORco的ORF全序列，并进行了相应的生物信息学分析。 2．本实验利用RT-qPCR分析了OR基因在松墨天牛同一组织不同发育状态、同一发育阶段不同组织之间的表达差异，同时研究了OR基因在雌雄触角中的表达差异。 3．本实验首次构建了MaltORco,MaltOR15和MaltOR45的PGH19表达载体。 4．本实验利用爪蟾卵表达技术结合双电极电压钳技术研究了MaltOR15和MaltOR45的功能。 5．首次鉴定出MaltOR45的识别配体气味包括长叶烯、月桂烯、苯甲酸丁酯、Hepetanal。