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玉米是我国三大禾本科粮食作物之一,既可作为粮食,也可作为重要的工业原料,在保证粮食生产及粮食安全方面发挥重要作用。但是玉米在生长过程中,经常遭受一些不良环境因子的影响,从而导致其产量和品质的下降,其中最主要的是非生物逆境因子,如高温、干旱及高盐等。目前,通过转基因技术进行作物遗传改良、培育抗逆新品种以提高作物抗逆性,是保证粮食产量和品质的最为行之有效的方法之一。研究表明,转录因子在植物的抗逆应答过程中发挥重要调控作用,它们可以同时激活或抑制多个下游基因的表达,效果更加显著,目前在植物中很多转录因子基因被鉴定参与逆境应答反应。HSF是植物中重要的转录因子家族之一,广泛参与到植物的生长发育及非生物逆境响应过程,在模式植物拟南芥及番茄中,HSF基因的作用机制已被研究清楚。然而,玉米作为重要粮食作物,其HSF基因的功能研究还未见报道,分子作用机制也不清楚。根据实验室相关研究基础,获得了一个潜在与逆境相关的HSF基因ZmHsfA4a,通过基因表达、基因特征以及过表达分析对其抗旱功能进行鉴定,并通过互作蛋白鉴定进一步阐明其作用机制。获得的主要结果如下: 1.从玉米B73中克隆得到ZmHsfA4a全长CDS序列,测序结果与B73基因组数据库公布序列完全一致,该基因全长1302bp,编码433个氨基酸。基因芯片数据显不ZmHsfA4a在玉米的各个组织中均有表达,其中在叶中表达水平较高,荧光定量PCR结果显示ZmHsfA4a在检测的六个组织,根、茎、叶、雄穗、花丝、及包被叶中均表达、且在叶中表达水平较高,这与芯片数据基本一致。诱导表达分析结果显示,ZmHsfA4a受到干旱和高温诱导表达,而在ABA和NaCl处理下呈下调表达。 2.亚细胞定位结果显示ZmHsfA4a-p1305融合蛋白只在细胞核中表达,表明ZmHsfA4a是一个核定位蛋白;转录活性分析结果表明,ZmHsfA4a在酵母AH109菌株中具有转录活性,并且主要活性区域位于230-280氨基酸之间。 3.构建过表达载体ZmHsfA4a-p1301a,通过农杆菌介导转化拟南芥。转基因拟南芥在含有300mM甘露醇的MS培养基上萌发率显著高于野生型,且在干旱条件下,转基因植株的耐受性增强。表达分析显示,转基因拟南芥中逆境相关基因在干旱处理之后的表达水平升高,并且高于野生型植株。 4.ZmHsfA4a过表达到水稻zhonghua11中,转基因水稻对干旱抗性增强。干旱处理后,转基因水稻植株的相对电导率及丙二醛含量显著低于野生型植株,并且干旱处理后一些逆境相关基因的表达水平在转基因植株中要高于野生型植株,这些结果进一步表明ZmHsfA4a增强了转基因水稻抗旱性。此外转基因水稻对外源ABA的敏感性增加,说明ZmHsfA4a参与水稻ABA介导信号通路。 5.过表达ZmHsfA4a增加了转基因玉米对干旱耐受性。相对失水率实验表明转基因植株相对于野生型植株的相对失水率较低,干旱处理后,转基因玉米的相对电导率及丙二醛含量显著低于野生型植株,但游离脯氨酸含量显著高于野生型植株,这表明转基因玉米抗旱性增强。对ABA含量测定发现,正常情况下转基因玉米与野生型植株没有差异,干旱处理后转基因玉米ABA含量显著高于野生型植株,并且ABA合成相关基因ZmVP14的表达与ABA含量趋势相一致,说明ZmHsfA4a参与了玉米ABA信号转导途径。BIFC和pulldown实验结果表明,ZmHsfA4a可以自身相互作用形成同源多聚体,并且ZmHsfA4a可以与EMP2相互作用。 以上实验结果表明,ZmHsfA4通过ABA介导信号转导途径参与干旱胁迫应答调控,同时EMP2参与了ZmHsfA4a的调控过程。