第一部分不同浓度饮食盐下慢性肾衰大鼠肾脏皮质的磷酸化蛋白质组学分析研究背景据报道慢性肾衰早期高血压的发生率为50%,发展到终末期有高血压者为60～100%,而持续存在的高血压又会加速慢性肾脏病的进展,形成恶性循环,因此积极控制血压在慢性肾衰的各阶段治疗中都具有重要意义。饮食盐的增加是促进高血压发生发展的最重要的环境因素,并且饮食盐的增加还具有独立于血压的作用,如导致左心室肥厚、动脉硬化、阻力血管狭窄、肾脏肥大和肾间质纤维化等。早在1976年Ylitalo研究小组就发现了在慢性肾衰的大鼠中存在盐敏感性。此后Koomans等人发现慢性肾衰的患者也存在盐敏感性。虽然关于慢性肾衰盐敏感性的研究很多,但在慢性肾衰中饮食盐是如何升高血压的机制并不完全清楚,主要包括：钠代谢异常,交感神经活性增强,内皮功能受损(NOS)、压力感受器受损等,上述的一系列机制大多与蛋白磷酸化信号途径的紊乱有关。虽然关于这方面的研究很多,但一般都局限于在特定生理或病理状态某一蛋白、某一通路的研究,没能在整体蛋白质水平上研究,不能形成一个统一的信号网络来研究慢性肾衰盐敏感性的机制。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究,从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生,细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质的翻译后修饰主要包括磷酸化、S-亚硝基化、乙酰甲基化和糖基化等,而蛋白质磷酸化是生物界最普遍,最重要,研究最多的一种蛋白质翻译后修饰(PTMs)蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆的过程,几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、细胞骨架调控、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等过程内的所有生命活动。目前有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起,包括肿瘤、糖尿病、免疫性疾病、心血管疾病等。肾脏中含有很多种磷酸化蛋白质,磷酸化修饰在调节肾脏正常生理功能中有着很重要的意义,但异常的磷酸化修饰会引起疾病,如WNK的异常磷酸化会引起高血压和破坏酸碱及电解质的平衡。因而分析蛋白质磷酸化修饰在不同生理病理状态下的相对变化,可以进一步发掘与疾病发生发展相关的重要生物标记物,为揭示其分子机理奠定基础。虽然蛋白质组学越来越多的用来鉴定组织中新的目标蛋白,来揭示其信号转导通路机制,但很少有研究运用磷酸化蛋白质组学技术研究慢性肾衰大鼠盐敏感性的机制。本研究的主要目的是运用磷酸化蛋白质组学技术研究在慢性肾衰大鼠中给予不同浓度的饮食盐所引起的差异性表达的磷酸化蛋白,从而阐明慢性肾衰发生、发展及盐敏感性的机制。研究方法一、动物模型的构建与组织样本的采集1、实验动物及饲养环境雄性Sprague Dawley大鼠(购自南方医科大学实验动物中心)体重150-180g,在SPF级环境实验动物饲养环境(南方医院实验动物中心)饲养,自由进水和饮食。2、大鼠5/6肾切除慢性肾衰模型制备大鼠体重200g左右行左侧肾脏2/3切,一周后进行右侧肾全切(完全保留双侧的肾上腺),假手术大鼠只进行肾包膜剥离。3、大鼠在手术后2、4、6、8、10周分别进行眼眶静脉采血,检测大鼠血肌酐、尿素氮水平。4、卖验分组,不同浓度饮食盐刺激大鼠2周在二期手术完成后的第9周,将慢性肾衰大鼠随机分组：(1) Sham+正常盐饮食饲料组(0.4%NaCl)(n=6)(2)CRF+正常盐饮食饲料组(0.4%NaCl)(n=6)(3)CRF+高盐饮食饲料组(4%NaCl)(n=6)分组后,测量尾动脉血压(softron BP-98A, Japan)作为基线血压。第十周开始给予不同浓度的饮食盐刺激大鼠2周。5、大鼠血、尿和肾脏组织的留取及处理1)术后第12周,测定大鼠血压后将大鼠放于代谢笼中,留取24小时尿。2)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠台上。3)开腹,腹主动脉采血,采血后迅速打开胸腔,灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速冲洗,可看到肾脏、肝脏、肺皮肤和肌肉等快速变苍白,右心耳流出液体无色清亮。4)迅速分离肾脏,放入盛有4℃预冷的1×PBS (PH7.4)的培养皿中清洗。5)剔除肾脏的被膜和周边脂肪,称重,分离肾脏的皮质,包于锡箔纸中,液氮速冻,-80℃保存。6、血肌酐和血尿素氮检测(采用临床自动生化分析仪检测)；24h尿蛋白定量：(采用考马斯亮蓝-G250法检测)。二、运用iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术对肾脏皮质进行磷酸化蛋白质组学分析1、蛋白提取每组各取适量组织块样品,各组内6样品等量混合,液氮研磨,裂解后取上清液采用BCA法蛋白质定量。2、SDS-PAGE电泳每组取约20μg蛋白质样品,按照5：1(v/v)比例加入5X上样缓冲液进行12.5%SDS PAGE电泳。3、酶解和肽段定量每组取约300gg蛋白样品,用UA buffer (8M Urea,150mM TrisHCl pH8.0)对蛋白烷基化后加入胰蛋白酶酶解,完成后OD280肽段定量。4、肽段标记每组取等量肽段(约80ug),按照试剂盒:iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit (AB SCIEX)说明书进行标记,重复标记1次。将标记后的肽段溶液混合,取1/10体积的混合肽段脱盐,然后进行质谱分析。取剩余的9/10体积混合肽段真空冻干,冻干后用于二氧化钛富集。5、二氧化钛富集标记后的混合肽段溶液真空冻干,加入1×DHB buffer复溶。溶液中加入Ti02beads,振荡40min,离心,移去上清液。将beads转入具塞tip头中,加入washing bufferl洗涤三次,加入washing buffer2洗涤三次。加入Elution buffer洗脱,收集磷酸化肽段,真空浓缩,用20μL0.1%FA溶解,取10gL用于质谱分析。6、质谱分析1)毛细管高效液相色谱样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC1000进行分离。2)质谱鉴定样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。7、数据分析1)质谱数据质谱分析原始数据为RAW文件,用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.3(Thermo Scientific)进行查库鉴定及定量分析。2)数据库本次使用数据库：ipi.RAT.v3.87.fasta(发布日期2011-2-27,蛋白质序列39925条)。3) Mascot搜索查库使用Mascot软件版本为Mascot2.2。查库时将RAW文件通过Proteome Discoverer提交至Mascot服务器,选择已经建立好的数据库,然后进行数据库搜索。4)定量分析Proteome Discoverer1.3软件根据肽段报告离子峰强度值进行定量分析。肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与其他标签的信号强度值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。最终定量结果再以各标签比值中位数进行归一化处理,以消除实验中人为因素引入的上样量误差。5) Phospho RS Note质谱数据由Mascot软件搜索后,再由Proteome Discoverer1.3软件对磷酸化肽段进行分析(Phospho RS score, PhosphopRS sequence probability, Phospho RSsite probabilities), Phospho RS score大于50分,Phospho RS site probabilities大于75%说明磷酸化修饰的可信度较高。三、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。两样本均数的比较采用两独立样本t检验；方差齐的多样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法：方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett’s T3法。p<0.05为差异有统计学意义。结果1.肾衰大鼠模型的确立在二步法5/6肾切除术后的第10周,测量各组大鼠的体重、血压并采血测定肌酐、尿素氮含量、24小时尿蛋白。在第10周时,各组大鼠的体重无明显变化(p<0.05),而CRF组收缩压、血肌酐和尿素氮、24小时尿蛋白较Sham组均显著升高(p<0.05)。2.不同浓度饮食盐对大鼠血压、24h尿蛋白和尿钠的影响在正常饮食盐中,CRF大鼠的血压和24h尿蛋白的明显改变(p<0.05)。在CRF大鼠中,与正常盐相比,CRF高盐组大鼠血压、尿钠和24h尿蛋白显著升高(p<0.05)。3.不同浓度饮食盐对大鼠肾脏皮质总蛋白的影响3.1总蛋白质谱鉴定运用蛋白质组学iTRAQ技术对各组肾脏皮质进行鉴定,鉴定出蛋白2725种,其中定量的蛋白有2695种。鉴定蛋白的定量比值频数分布显示大部分蛋白质Ratio比值(NC/NS, HC/NC)接近1,呈对称分布,符合统计学规律。3.2差异蛋白比值频数分布对有定量信息的蛋白质进行比较,并计算其显著性指数。在正常饮食盐中,与Sham大鼠比较(NC/NS), CRF大鼠有318种蛋白差异表达(p<0.05),其中有164种蛋白表达升高,154种蛋白表达下降；在CRF大鼠中,与正常饮食盐比较(HC/NC),高盐CRF大鼠有310种蛋白差异表达(p<0.05),其中157种蛋白表达升高,153种蛋白表达下降。4.不同浓度饮食盐对大鼠肾脏皮质磷酸化肽段的影响4.1磷酸化肽段鉴定运用磷酸化蛋白质组学iTRAQ技术对各组肾脏皮质进行鉴定,鉴定出磷酸化的肽段1911种,有定量信息的磷酸化肽段1810种,对应989种磷酸化蛋白。鉴定磷酸化肽段的定量比值频数分布显示大部分磷酸化肽段Ratio比值(NC/NS, HC/NC)接近1,呈对称分布,符合统计学规律。4.2磷酸化肽段位点的分布对1810种有定量信息的磷酸化肽段进行磷酸化位点的鉴定,鉴定出2565个磷酸化位点,一个位点发生磷酸化的肽段最多,其次是两位点发生磷酸化的肽段(1P1151、2P583、3P59、>4P17)。4.3总磷酸化肽段的GO分类利用在线的Panther数据库,对有定量信息的磷酸化肽相应的磷酸化蛋白进行功能分类。在质谱鉴定出的肾脏皮质磷酸化蛋白中,蛋白结合分子和催化活性分子是最主要的功能蛋白。对有定量信息的磷酸化肽相应的磷酸化蛋白进行生物学过程分类。肾脏皮质磷酸化蛋白参与了代谢、生物调节、细胞组成、增殖、分化和凋亡等生物学过程,其中以代谢最多,其次是生物调节、转运过程。4.4饮食盐对肾脏皮质磷酸化肽段的影响对有定量信息的磷酸化肽段进行比较,并计算其显著性指数。在正常饮食盐中,与Sham大鼠比较(NC/NS), CRF大鼠有197种磷酸化肽段差异表达(p<0.05),其中有113种磷酸化肽段表达升高,84种磷酸化肽段表达下降；在CRF大鼠中,与正常饮食盐比较(HC/NC),高盐CRF大鼠有169种磷酸化肽段差异表达(p<0.05),其中78种磷酸化肽段表达升高,91种磷酸化肽段表达下降。4.5差异磷酸化蛋白的GO分类利用在线的Panther数据库,对差异磷酸化肽相应的磷酸化蛋白进行功能分类,忽略未分类的磷酸化蛋白,在正常饮食盐中,慢性肾衰所引起的差异磷酸化肽对应的磷酸化蛋白的主要功能是结合蛋白核酸和催化活性(NC/NS)；在慢性肾衰大鼠中,高盐引起的差异磷酸化肽对应的磷酸化蛋白的主要功能也是结合蛋白核酸和催化活性(HC/NC)。根据生物学过程分类,在正常饮食盐中,慢性肾衰所引起的差异磷酸化肽对应的磷酸化蛋白蛋白参与了代谢、生物调节、细胞组成、增殖、分化和凋亡等生物学过程,其中以代谢最多,其次是生物调节、转运过程(NC/NS);在慢性肾衰大鼠中,高盐引起的差异磷酸化肽对应的磷酸化蛋白也参与了代谢、生物调节、细胞组成、增殖、分化和凋亡等生物学过程,其中以代谢最多,其次是生物调节、转运过程(HC/NC)。这些反映了慢性肾衰发生发展及盐敏感性形成是复杂广泛的调节模式。4.6差异磷酸化蛋白信号通路分析通过DAVID6.7在线分析软件,对NC/NS组149种差异磷酸化蛋白和HC/NC组127种差异磷酸化蛋白所涉及到的KEGG信号通路进行了分析。结果显示,NC/NS组31种差异磷酸化蛋白所涉及到多种物质代谢、病灶粘连、缝隙连接、MAPK、ErbB、mTOR、VEGF、Notch、NOD-like receptor、Calcium等信号通路,其功能涉及细胞增殖、细胞周期、细胞通讯和凋亡、药物代谢、醛固酮调节钠的重吸收等过程。HC/NC组32种差异磷酸化蛋白所涉及到多种物质代谢、病灶粘连、粘附连接、mTOR、VEGF、Insulin等信号通路,其功能涉及细胞增殖、细胞周期、细胞通讯和凋亡、药物代谢等过程。4.7差异磷酸化蛋白的相互作用分析利用String数据库对NC/NS, HC/NC两组差异磷酸化蛋白质作了进一步分析,在NC/NS差异磷酸化蛋白质中,36个差异磷酸化蛋白质被网络,这些磷酸化蛋白质很可能是慢性肾衰发生发展相关信号通路中的成员。信号通路网络中连接最多的3个蛋白分别是Polr2a、Srrm1、Srrm2,说明这3个磷酸化蛋白为慢性肾衰发生发展相关信号通路网络的中心节点,它们可能是慢性肾衰发生发展相关信号通路磷酸化的重要靶点。在HC/NC差异磷酸化蛋白质中,24个差异磷酸化蛋白质被网络,这些磷酸化蛋白质很可能是慢性肾衰盐敏感性形成的相关信号通路中的成员。信号通路网络中连接最多的8个蛋白分别是Lmna、Des、 Tnni3、Mydpc3、Vcl、Myh6、Myh7、Myh11,说明这8个磷酸化蛋白为慢性肾衰盐敏感性形成的相关信号通路网络的中心节点,它们可能是慢性肾衰盐敏感性形成的相关信号通路磷酸化的重要靶点。结论1.成功运用iTRAQ技术对大鼠肾脏皮质进行了磷酸化蛋白质组学分析,构建了慢性肾衰大鼠肾脏皮质磷酸化蛋白质谱；鉴定出1911种磷酸化肽段,有定量信息的1810种,对应989种磷酸化蛋白；2.发现149种差异磷酸化蛋白可能与慢性肾衰发生发展有关及127种差异磷酸化蛋白可能与慢性肾衰盐敏感性的形成有关；3.基于鉴定的慢性肾衰发生发展及盐敏感性形成相关信号通路的磷酸化蛋白质,建立慢性肾衰发生发展及盐敏感性形成相关信号通路的磷酸化蛋白质的信号网络。第二部分盐摄入对慢性肾衰大鼠脑内孤束核肾素血管紧张素系统的影响研究背景慢性肾脏病的防治已成为世界各国所面临的重要公共卫生问题之一,而慢性肾衰是慢性肾脏病进展至一定时期时出现的代谢紊乱和临床症状组成的综合征。CRF患者大部分有不同程度的高血压,其发生率为60%-100%,持续存在的高血压又会加速慢性肾脏病的进展,形成恶性循环,因此积极控制血压在慢性肾衰的各阶段治疗中都具有重要意义。众所周知饮食盐的增加是促进高血压发生发展的最重要的环境因素,早在早在1976年Ylitalo研究小组就发现了在慢性肾衰的大鼠中存在盐敏感性,此后Koomans等人发现慢性肾衰的患者也存在盐敏感性,但这种盐敏感性的机制尚不完全清楚。肾素血管紧张素系统在慢性肾衰高血压的形成与发展起着很重要的作用,除了循环的RAS参与了这样过程,脑部的RAS也同样参与了高血压的形成。早在1995年Teruya等人就证实了盐敏感性与脑血管紧张素有关,随随后Leenen研究小组在Dahl盐敏感性大鼠的研究中发现高盐可作用于脑部的肾素血管紧张素系统,而且盐摄入与交感神经活性呈正相关。在自发性高血压大鼠(SHR),高盐饮食引起的交感神经过度活动和血压的恶化能够被AT1受体阻断剂氯沙坦阻止；在高盐饮食的Dahl S大鼠,脑室内注射氯沙坦阻止了交感神经的过度活动,抑制血压的升高。可见中枢的RAS与慢性肾衰盐敏感性的形成密切相关,但具体机制尚不清楚。在脑内存在所有RAS的组分,脑内的RAS系统可通过调节交感神经活性在血压的调节中起着重要的作用,尤其与心血管调控系统有关的脑干区域(孤束核NTS、头端腹外侧核RVLM).在这些区域中,孤束核是迷走神经和舌咽神经终端的起始部位,是调节压力感受器反射和动脉血压调定点设置的重要区域。有研究证实在孤束核内微量注射ANGⅡ可以消弱压力感受器的敏感性,引起高血压。循环中升高的ANGⅡ可以通过血脑屏障作用有NTS,降低压力感受器的敏感性,且脑内注射AT1受体阻断剂可以完全去除这一作用。从而推断NTS里的RAS在血压的调控中起着作用的作用。本研究以慢性肾衰大鼠为模型,通过用不同浓度的盐对慢性肾衰大鼠进行干预,观察慢性肾衰大鼠脑部孤柬核RAS变化,在高盐饮食下给予脑内注射氯沙坦,探索慢性肾衰大鼠盐敏感性形成的机制。一、动物模型的构建与组织样本的采集1、大鼠5/6肾切除慢性肾衰模型制备及其盐刺激大鼠体重200g左右行左侧肾脏2/3切,一周后进行右侧肾全切(完全保留双侧的肾上腺),假手术大鼠只进行肾包膜剥离。大鼠在手术后2、4、6、8、10周分别进行眼眶静脉采血,检测大鼠血肌酐、尿素氮水平。在二期手术完成后的第9周,将假手术和一部分慢性肾衰大鼠随机分组：分组后,测量尾动脉血压(softron BP-98A, Japan)作为基线血压。第十周开始给予不同浓度的饮食盐刺激大鼠2周。2、高盐慢性肾衰大鼠脑室注射沙坦钾在二期手术完成后的第9周,将另一部分慢性肾衰大鼠随机分组：(1)CRF+高盐饮食(n=15)(2)CRF+高盐饮食+脑室内注射人工脑脊液(I.C.V CSF,12μl/24h)(n=15)(3)CRF+高盐饮食+脑室内注射氯沙坦钾(I.C.V losarta,1mg/kg体重·d,体积12μl/24h)(n=15)分组后,测量尾动脉血压(softron BP-98A, Japan)作为基线血压。脑室内注射泵的植入：脑室内注射采用ALZET微渗透压泵(型号：2002)配合ALZET Brain Infusion Kit2套装。第十周开始给予高盐饮食刺激大鼠2周3、大鼠血、尿和脑组织的留取及处理1)术后第12周,测定大鼠血压后将大鼠放于代谢笼中,留取24小时尿。2)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠台上。3)开腹,腹主动脉采血,采血后迅速打开胸腔,灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速冲洗,可看到肾脏、肝脏、肺皮肤和肌肉等快速变苍白,右心耳流出液体无色清亮4)每组部分老鼠(5只)4℃预冷的生理盐水快速灌注后,换为4℃的4%多聚甲醛液(PH7.2)400ml灌注1.5h,之后小心剪开颅骨取脑,在大鼠脑模具内,分离孤束核,,置4%的多聚甲醛液内固定,用于做脑组织石蜡切片的免疫组化。5)每组剩余的老鼠(5只)4℃预冷的生理盐水快速灌注后,开颅骨取脑,在大鼠脑模具内,分离孤束核,包于锡箔纸中,液氮速冻,-80℃保存。二、检测血中的肌酐、尿素氮、血钠、24h尿蛋白、尿钠三、Real-time PCR检测脑内孤束核肾素-血管紧张素系统AGT、ACE、AT1R mRNA水平的表达取各组大鼠孤束核组织放于1.5ml EP管,按组织重量：TRIZOL=1:10的比例进行反复吹打,提取组织RNA,逆转录,qRT-PCR检测AGT、ACE、AT1mRNA水平的表达。四、免疫组化检测脑内孤束核肾素-血管紧张素系统AGT、ACE、ANGⅡ、AT1R蛋白水平的表达五、Western Blotting检测孤束核组织ACE、AT1R蛋白水平的表达。将储存于-80℃内的组织取出,称重,按组织重量：裂解液=1：4的比例加入裂解液,用5m1注射器反复吹打组织,以上操作均在冰上进行,匀浆完全后,13000g,4℃离心40min,去掉漂浮于上层的脂滴,提取中间层的匀浆液,即为孤束核组织的总蛋白,加入SDS(5×)上样缓冲液,95℃煮沸蛋白,Western Blotting检测孤束核组织ACE、AT1R蛋白水平的表达。六、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；两样本均数的比较采用两独立样本t检验；方差齐的多样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett’s T3法。p<0.05为差异有统计学意义。结果1、肾衰大鼠模型的确立在二步法5/6肾切除术后的第10周,测量各组大鼠的体重、血压并采血测定肌酐、尿素氮含量、24小时尿蛋白。在第10周时,各组大鼠的体重无明显变化(p<0.05),而CRF组收缩压、血肌酐和尿素氮、24小时尿蛋白较Sham组均显著升高(p<0.05)。2.不同浓度饮食盐对大鼠血压的影响在Sham大鼠中,与正常盐比较,给予低盐或高盐饮食14天均未能引起血压的明显改变(p>0.05)。在CRF大鼠中,与正常盐相比,给予低盐饮食未引起血压的显著下降(p>0.05),而高盐饮食引起血压显著升高(p<0.05)。3.不同浓度饮食盐对大鼠24h尿蛋白的影响在Sham大鼠中,与正常盐比较,给予低盐或高盐饮食14天均未能引起24h尿蛋白的明显改变(p>0.05))。在CRF大鼠中,与正常盐相比,给予低盐饮食未引起24h尿蛋白的显著下降(p>0.05),而高盐饮食引起24h尿蛋白显著升高(p<0.05)4.不同浓度饮食盐对大鼠体重、血钠和尿钠的影响无论在Sham还是CRF大鼠中,与正常盐比较,给予低盐或高盐饮食14天对体重无显著改变(p>0.05),但低盐饮食减少尿钠的排泄,高盐饮食增加尿钠的排泄(p<0.05)；低盐或高盐饮食对Sham大鼠的血钠无显著改变(p>0.05),高盐饮食升高CRF大鼠的血钠(p<0.05)。5.不同浓度饮食盐对大鼠脑孤束核(NTS)部位RAS的影响5.1不同浓度饮食盐下孤束核(NTS)部位RAS mRNA的表达在正常盐饮食中,CRF大鼠脑部NTS部位AGT、ACEmRNA的表达与Sham大鼠相比显著增强(p<0.05)；在低盐饮食中,CRF大鼠脑部NTS部位AGT、AT1mRNA的表达与Sham大鼠相比显著增强(p<0.05)；在高盐饮食中,CRF大鼠脑部NTS部位ACE、AT1mRNA的表达与Sham大鼠相比显著增强(p<0.05)；无论在Sham还是CRF大鼠中,与正常盐相比,高盐盐饮食增加脑部NTS部位AGT、 ACE、AT1mRNA的表达(p<0.05)。5.2不同浓度饮食盐下孤束核(NTS)部位RAS蛋白水平的表达无论在低盐、正常盐或是高盐饮食中,CRF大鼠脑部NTS部位AGT、ACE、 ANGⅡ、AT1的表达与Sham大鼠相比显著增强(p<0.05)；在Sham大鼠中,与正常盐相比,低盐饮食抑制脑部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表达(p<0.05),高盐无明显改变；在CRF大鼠中,与正常盐相比,低盐饮食抑制脑部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表达(p<0.05),高盐饮食增加脑部NTS部位AGT、 ACE、ANGⅡ、AT1的表达(p<0.05)。6.脑室内注射氯沙坦钾对高盐饮食的慢性肾衰竭大鼠血压的影响在高盐饮食的CRF大鼠中,与高盐CRF大鼠相比,给予脑室内注射CSF对血压无明显影响,而脑室内注射氯沙坦时血压明显下降(p<0.05)。7.脑室内注射氯沙坦钾对高盐饮食的慢性肾衰竭大鼠24h尿蛋白的影响在高盐饮食的CRF大鼠中,与高盐CRF大鼠相比,给予脑室内注射CSF对24h尿蛋白无明显影响,而脑室内注射氯沙坦时24h尿蛋白明显下降(p<0.05)。8.脑室内注射氯沙坦钾对高盐饮食的慢性肾衰竭大鼠脑孤束核(NTS)部位RAS的影响8.1脑室内注射氯沙坦钾时高盐饮食的慢性肾衰竭大鼠孤束核(NTS)部位RAS mRNA的表达在高盐饮食的CRF大鼠中,给予脑室内注射氯沙坦,观察其对NTS部位RAS mRNA的影响情况,结果显示：与高盐CRF大鼠相比,脑室内注射氯沙坦抑制AGT、ACE、AT1R mRNA的表达(p<0.05)。8.2脑室内注射氯沙坦钾时高盐饮食的慢性肾衰竭大鼠孤束核(NTS)部位RAS蛋白水平的表达在高盐饮食的CRF大鼠中,与高盐CRF大鼠相比,给予脑室内注射CSF对NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、ATI均无明显影响(p>0.05),而脑室内注射氯沙坦时NTS部位AT1表达明显减少,反馈性引起AGT、ACE、ANGⅡ表达显著升高(p<0.05)。结论1、在慢性肾衰大鼠中,脑内孤束核的肾素血管紧张素系统出现异常活化,高盐可以增强慢性肾衰大鼠NTS部位RAS的进一步活化。2、在慢性肾衰大鼠中,脑内孤束核的肾素血管紧张素系统参与了盐敏感性的形成。