第一部分 失敏态脑N受体药理学特征 N受体失敏是指胆碱能N受体在激动剂的反复或长期刺激下对激动剂的反应降低或丧失。传统观点认为，失敏态N受体是一种无功能状态。但是，本研究室的前期工作表明失敏态N受体只是不再介导N样反应，并非处于无功能状态，而是具有特定的生物学作用。基于脑科学研究的神经网络学观点，本文从基因表达、蛋白质功能及整体行为学表现等不同层次探讨了N受体失敏对脑功能的影响，为进一步了解失敏态脑N受体的药理学特征，分析失敏态脑N受体在烟碱耐受和成瘾中的重要作用提供了一定的实验依据。 一．N受体失敏时脑内神经生物学相关基因表达谱的变化 大鼠予以1.2mg／kg剂量的烟碱皮下注射，每天两次，连续用药两周后取全脑，提取总RNA，逆转录合成cDNA，体外转录合成生物素化RNA，并将其片断化后与芯片杂交，对荧光强度进行扫描分析，并用RT-PCR方法验证芯片分析结果。实验结果显示反复摄入烟碱诱导N受体慢性失敏时，脑内共有224个基因表达发生变化。其中，有94个蛋白激酶、膜受体和离子通道相关的基因表达发生改变。在蛋白激酶中，丝裂原激活的蛋白激酶等13种上调，三磷酸肌醇等6种激酶表达下调；在膜受体中，N-甲基-天门冬氨酸受体等9种表达上调，谷氨酸受体D等14种表达下调；钾、钠和钙通道的基因表达均发生变化：电压依赖性K⁺通道中外向整流型K⁺通道和Ca²⁺激活的K⁺通道表达下调，而Kv2.3r等电压依赖性K⁺通道表达上调；电压依赖性Na⁺通道的β₂亚基表达增加，而α和β₁亚基基因表达减少；电压依赖性Ca²⁺通道的β₃亚基基因表达增加。反复给予烟碱诱导N受体失敏时，脑内膜受体基因、信号转导相关基因和离子通道基因的表达水平发生的上述变化可能与烟碱耐受和成瘾密切相关。南京医科大学博士学位论文 二.烟碱诱导N受体失敏对脑内蛋白激酶A和C功能的影响 在烟碱诱导大鼠脑N受体分别处于激动态、亚急性失敏、急性失敏和慢性失敏态时，取大鼠全脑匀浆。分别加入PKA特异性生物素化底物Kemptide和PKe特异性生物素化底物决uro脚nine，用’ZP掺入底物法测定脑内蛋白激酶A和C的活性。同时，结合基因芯片实验分析慢性失敏时PKA和PKC相关基因表达的变化。研究结果显示:N受体激动状态下对PKA和PKC的活性没有影响;N受体处于亚急性失敏、急性和l漫性失敏状态时，使PKA和PKC的活性降低。基因芯片研究结果显示二慢性失敏时，PKCIn基因表达增加，而PKC中a、Y、花等亚基的基因表达没有变化;cAN[P反应元素结合蛋白、cANIP反应元素调节因子、cAMP磷脂酶、cAN于依赖性蛋白激酶H等6种基因表达也无明显改变。 实验结果提示:烟碱作用使N受体失敏时，可降了却亩内PKA和PKC的活性，使脑内信号转导通路发生适应性改变，这些变化是烟碱成瘾的重要的生化基础。 三.失敏态脑N受体对其它递质受体功能的调节 在N受体失敏的小鼠及大鼠动物模型上，以小鼠的自主活动、延缓的非匹配位置作业中大鼠选择游泳的正确率及时间为检测指标，观察N受体失敏对多巴胺受体、a:肾上腺素受体、5一HT IA受体、阿片受体、GABA受体以及M受体功能的影响。研究结果显示:N受体失敏增强阿扑吗啡对小鼠自主活动的调节作用;减弱可乐定、8一OH一DPAT和安定对小鼠自主活动的的抑制作用;但不影响吗啡对小鼠自主活动的调节。在安定致学习记，忆损伤的动物模型上，N受体失敏可改善大鼠的学习记忆能力;而在阿托品致学习记，忆损伤的动物模型上，N受体失敏对大鼠的学习记J忆能力没有明显影响。上述实验结果表明:N受体失敏时，影响脑内多种递质受体的功能，同样提示脑N受体失敏可以调节神经网络系统的功能。南京医科大学博士学位论文 第二部分神经性N受体介导的神经元保护作用及其机制的研究 以高浓度谷氛酸（smmol.L一l）诱导PC12细胞产生兴奋性毒性为实验模型，通过M竹试验、共聚焦显微镜、RT一PCR以及免疫细胞化学等技术，观察烟碱诱导N受体失敏时对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用和N受体拮抗剂美加明对烟碱作用的影响，并进一步研究N受体失敏对月包内钙离子浓度以及对凋亡相关因子bc}一2和bax基因及蛋白表达的调节，以探讨神经性N受体产生细胞保护作用的可能途径。 研究结果显示10 nmol.L一’一1.0^ol.L一’浓度范围内烟碱能对抗谷氨酸造成的兴奋性毒性，该保护作用可被美加明（1尽mol.L’）所阻断，提示N受体介导烟碱的保护作用。烟碱预孵育24h可增加对谷氨酸引起的钙超载的缓冲作用，上调bel一21宜RNA和蛋白的表达，下调bax及其蛋白的表达。上述这些调节作用与神经性N受体介导的细胞保护作用有关。