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研究背景:皮肤老化不仅是一种随年龄增长而导致的皮肤生理性改变,更是一种由外界环境影响导致的病理状态。紫外线（ultravioletB,UVB）照射导致的光老化是其产生的主要原因。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）是一种具有多向分化潜能且能分泌多种生物活性因子的多能间充质干细胞,因其来源丰富、易于获得、免疫排斥反应低而成为当前研究的热点。目前已有部分临床研究和动物实验表明ASCs能有效改善老化皮肤,但ASCs改善老化皮肤的作用机制目前仍尚未完全阐明。研究目的:1.探究ASCs是否通过影响正常及紫外线损伤的皮肤成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts,HDFs）的功能从而达到改善老化皮肤的效果。2.研究ASCs对细胞外基质重塑相关细胞因子（包括MMP1、TGF-β1、EGF和IGF-1）的影响,通过动物实验进一步探究ASCs注射后皮肤细胞外基质的变化趋势,并进一步验证细胞外基质重塑相关细胞因子的变化。3.明确ASCs对皮肤紫外线照射后氧化应激损伤的保护作用及其作用机制。4.在动物实验中研究ASCs对于皮肤血流量和局部组织水含量变化的影响,并初步阐明其机制。研究方法:1.从脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,鉴定干细胞特异性表型及其成脂分化和成骨分化能力。2.将HDFs分为四组:正常HDFs组（空白对照）、UVB照射光老化HDFs组、ASCs与正常HDFs共培养组和ASCs与光老化HDFs共培养组,检测HDFs的增殖、凋亡、衰老和迁移等功能的变化。3.通过western blotting和RT-PCR从蛋白水平和基因水平检测ASCs对HDFs细胞外基质重塑相关细胞因子（包括MMP1、TGF-β1、EGF和IGF-1）表达的影响,使用ELISA法测定细胞培养液中相关细胞因子的表达水平。4.建立光老化小鼠和自然老化小鼠模型,向造模成功的小鼠背部两侧分别注射ASCs和PBS。在注射后第3周至第7周对小鼠皮肤样本进行皮肤结构的组织学分析,评估小鼠皮肤皱纹变化、真皮厚度和胶原蛋白的含量等皮肤结构的改变,使用RT-PCR、ELISA和免疫组化方法检测小鼠皮肤组织中细胞外基质重塑相关因子的表达变化。5.检测细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的变化以及氧化应激相关通路细胞因子Nrf2和IL-6的表达变化。并在动物实验中进一步验证ASCs改善老化皮肤时减少氧化应激损伤所发挥的作用。6.使用激光散斑对比成像系统和MoistureMeter-D组织水含量测量仪检测光老化小鼠和自然老化小鼠皮肤血流量和局部组织水含量（Local Tissue Water,LTW）的变化,并检测血管生成相关因子的表达差异。研究结果:1.UVB照射显著增加了 HDFs衰老细胞的数量、显著降低HDFs的增殖能力并促进其凋亡,但UVB照射对于HDFs的迁移能力并没有显著的影响。与ASCs共培养可以减少UVB照射后HDFs衰老细胞的数量,但是ASCs共培养对于正常HDFs细胞衰老的改善并没有统计学差异;无论是正常HDFs还是光老化的HDFs,其增殖能力和迁移能力都有了显著的增加,而细胞凋亡减弱;2.ASCs可以抑制HDFs分泌MMP1,减少胶原蛋白的降解;同时ASCs可以增加HDFs分泌TGF-β1,促进胶原蛋白合成。在UVB照射光老化小鼠组中,ASCs注射侧MMP-1减少起主要作用,主要通过减少胶原降解,来增加胶原蛋白的含量,使得真皮增厚。但是在自然老化小鼠组中,ASCs注射侧TGF-β1升高起重要作用,主要通过促进胶原蛋白的合成使真皮增厚。3.ASCs可以显著降低皮肤中ROS的表达。ASCs注射后,氧化应激相关通路的Nrf-2表达无明显影响,但是IL-6的表达增加。4.注射7周后,UVB照射光老化组小鼠ASCs注射侧血流灌注量明显高于PBS注射侧血流灌注。而自然老化组小鼠双侧血流灌注量无明显差异。CD31免疫组织染色显示小鼠皮肤毛细血管的数量和促血管生成因子VEGF、IGF-1和EGF水平在两组ASCs注射侧都显著高于PBS注射侧。5.在自然老化小鼠组中,在注射后7周内,ASCs注射侧和PBS注射侧的LTW没有显著差异。而在UVB照射光老化小鼠组,PBS注射侧LTW含量在注射后第7周逐渐升高。研究结论:1.总体来说,ASCs的旁分泌作用在UVB照射组和未照射组均能显著改善HDFs的衰老、增殖、凋亡和迁移能力。与UVB照射的光老化HDFs相比,正常的HDFs在与ASCs共培养时表现出更强的增殖和迁移能力,更低的凋亡率和更少的衰老细胞。2.ASCs通过旁分泌作用使得HDFs中ECM相关细胞因子在基因和蛋白水平发生了变化,从而达到重塑细胞外基质结构,改善老化皮肤的目的。3.ASCs通过减少ROS的含量和干预氧化应激通路相关因子的表达,有效减少了氧化应激造成的皮肤损伤。4.ASCs可能主要影响真皮下层相对健康的HDFs,使其竞争性的替换衰老的真皮上层HDFs,从而达到改善皮肤老化的作用。5.注射7周后,ASCs注射侧小鼠皮肤血液灌注量增加、毛细血管的数量增多、促血管生成相关因子表达增加。6.UVB照射光老化小鼠组中,PBS注射侧LTW含量在注射后第7周显著升高。推论:因为皮肤中红细胞的数量与皮肤组织含水量呈反比关系,所以,随着光老化小鼠毛细血管数量的减少,皮肤中LWT增加。