动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种多因素参与的复杂病变，涉及多种细胞的相互作用，包括内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞以及淋巴细胞等。粥样硬化斑块的形成和进展最终影响受损器官灌注，导致心脑血管疾病。AS的发病机制目前仍不明确，但越来越多的研究者倾向于认为AS是一种免疫炎症反应，CD4+T细胞在其中起重要作用。不同表型T细胞分泌不同的炎症因子，在AS发病中发挥不同的作用。多数研究结果认为：Th1及其分泌的IL-2、IL-12、干扰素-γ等细胞因子有促AS作用，而Th2及其分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子则有抗动脉粥样硬化作用。Th1、Th2所介导的免疫反应的消长以及整个免疫稳态的调节控制着疾病的发生和发展。调节性T细胞(Treg)是近年发现的T细胞特殊亚型，其具有免疫应答低下和免疫抑制两大特征，在人体免疫耐受以及免疫调节方面发挥重要作用，近年来多项研究证实，调节性T细胞在动脉粥样硬化中可通过多种途径发挥免疫调节作用来抑制病变的发生和发展。叉头状螺旋转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)在调节性T细胞的发育成熟以及调节功能维持方面有重要作用，同时被证实有抗动脉粥样硬化作用。Treg自身产生的TGF-β1和IL-10等细胞因子介导了Treg对动脉粥样硬化的抑制功能。目前国内外相关研究多以外周血或淋巴组织Treg为主，极少研究斑块局部Treg细胞的分布，故Treg抗动脉粥样硬化局部作用可能机制及其与外周循环Treg分布关系仍不明确，本研究通过建立不同病变程度动脉粥样硬化小鼠模型，通过检测小鼠脾脏及斑块局部Treg分布情况以及相关细胞因子表达以进一步探讨CD4+CD25+treg细胞在动脉粥样硬化发病中可能的作用机制。　　 研究目的：　　 观察ApoE基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠主动脉组织粥样硬化病变情况，检测实验鼠脾脏和斑块局部CD4+CD25+treg分布情况以及血清TGF-β1、IL-10两种细胞因子浓度，进一步探讨CD4+CD25+treg在动脉粥样硬化发病中的作用机制。　　 研究方法：　　 1、实验动物　　 实验动物共30只，均为8周龄雄性小鼠，购自北京大学医学部实验动物部[SCXK(京)2006-0008]。ApoE-/-小鼠20只(品系为C57BL/6J，源自美国Jackson实验室)建立AS模型，随机(随机数字表法)分为ApoE-/-+高脂饮食(AH组)、ApoE-/-+普通饮食(AN组)，C57BL/6J小鼠10只，给予普通鼠料，为实验对照组(BN)；高脂饲料(2％胆固醇、0.2％丙基硫氧嘧啶、15％猪油、5％蛋黄、普通鼠料)及鼠标准普通饲料均购自广东医学实验动物中心[SCXK(粤)2008-0002，粤监证字2008D007]。全部小鼠饲养于中山大学公共卫生学院动物中心SPF级环境内，动物饲养笼具、饮水瓶定期消毒，所用垫料高压灭菌，饲养房内定期紫外线灯消毒，全部小鼠饲养12周。　　 2、实验方法　　 全部实验鼠喂养12周后，4％水合氯醛(0.8-1mg/g)腹腔注射麻醉，快速剪开胸腔，暴露心脏，左心室穿刺取血，离心20分钟，分离出血清，4℃冰箱中保存，备行细胞因子检测；取血后，先后以0.9％氯化钠溶液及4％多聚甲醛从左心室灌注主动脉，将主动脉从根部至髂动脉分叉处离断取出，4％多聚甲醛固定，从主动脉根部开始至600μm处，行连续石蜡切片，切片厚5μm，每张切片连续贴3个组织面，每间隔10张取1张切片，每只鼠选4张切片，分别行HE染色、弹力纤维染色(Verhoeff氏铁苏木精染色)、Foxp3及CD25免疫组织化学染色；分离脾脏，将脾脏放置于200目不锈刚网上研磨制备脾细胞悬液，立即送流式细胞检测。以HE染色观察血管形态学变化，Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算血管内膜厚度、中膜厚度、内膜/中膜厚度比值、斑块面积、管腔面积、斑块面积/管腔面积比值等指标；Verhoeff氏铁苏木精纤维染色观察弹性纤维排列情况；ELASA法检测小鼠血清TGF-β1、IL-10两种细胞因子浓度；流式细胞术检测脾脏CD4+CD25+treg细胞/CD4+细胞比例；免疫组化法检测主动脉壁Foxp3和CD25的表达，IPP6.0软件计算斑块局部Foxp3、CD25阳性细胞数/淋巴细胞数比值。　　 3、数据处理和统计分析　　 采用SPSS13.0对数据进行统计分析及Error Bar统计图制作，数据结果均以样本均数±样本标准差(Mean±Std.Deviation)表示，两样本定量资料比较采用W检验进行正态性检验后使用两独立样本的t检验(Independent-Samples T Test)。P＜0.05有统计学意义。　　 实验结果：　　 1、ApoE-/-小鼠动脉壁可见不同程度动脉粥样硬化斑块形成，对照组C57BL小鼠无斑块形成；ApoE-/-+普通饮食(AN组)组小鼠动脉内膜厚度(μm)、I/M比值、斑块面积(μm2)、斑块/管腔比值均高于C57BL小鼠+普通饮食(BN)组(12.24±1.34vs7.33±2.23，0.658±0.167vs0.429±0.145，600265.4±263876.25vs0，15.93±5.45vs0)，差异有统计学意义(P＜0.01)；　　 2、ApoE-/-+高脂饮食(AH)组小鼠动脉内膜厚度(μm)、斑块面积(μm2)、斑块/管腔比值均高于ApoE-/-+普通饮食(AN)组(14.80±3.42vs12.24±1.34，905265.9±259356.16vs600265.4±263876.25，25.08±7.38vs15.93±5.45)，差异有统计学意义(P＜0.05)；　　 3、AN组小鼠外周血TGF-β1、IL-10浓度(pg.ml-1)及脾脏CD4+CD25+treg细胞比例(％)较对照组减低(116.05±32.27vs191.27±95.27，41.83±16.15vs61.84±23.05，9.4±4.00vs13.8±3.97)，差异有统计学意义(P＜0.05)；　　 4、AH组外周血TGF-β1、IL-10浓度(pg.ml-1)及脾脏CD4+CD25+treg细胞比例(％)较AN组减低(83.97±33.45vs116.05±32.27，27.50±11.54vs41.83±16.15，5.8±1.51vs9.4±4.00)，差异有统计学意义(P＜0.05)；　　 5、ApoE-/-小鼠动脉壁斑块内有不同程度的Foxp3和CD25表达，AH组Foxp3、CD25阳性细胞/淋巴细胞比值较AN组减低(1.28±1.20vs3.04±1.92，2.00±1.39vs3.98±1.67)，差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组(BN组)小鼠主动脉壁内膜无Foxp3、CD25表达。　　 实验结论：　　 1、ApoE基因敲除小鼠动脉壁可见不同程度动脉粥样硬化斑块形成，对照组C57BL小鼠无斑块形成，证实ApoE基因敲除小鼠是研究AS病变较理想的动物模型，辅以不同的饮食干预可形成不同病变程度的斑块，以同种野生型C57BL小鼠做阴性对照组，为AS的横向及纵向对比研究奠定了良好的模型基础；　　 2、动脉粥样硬化病变鼠脾脏CD4+CD25+treg比例减低、外周血抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10减少，以上结果与近年来多项研究成果一致。同时，本实验结果提示：AS后期病变鼠较早期病变者，上述指标进一步减少；　　 3、正常血管壁内膜无CD4+CD25+treg细胞存在，AS各期病灶局部均有少量CD4+CD25+treg细胞分布，动脉粥样硬化病变后期斑块局部Treg细胞分布较早期病变者减少，提示AS发病与Treg数目变化有相关；　　 AS病变鼠外周淋巴组织及斑块局部CD4+CD25+treg细胞明显减少，外周血抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10减少，上述指标变化与AS病变程度有相关，提示CD4+CD25+treg在抗动脉粥样硬化中的重要作用。