胶质母细胞瘤是成人中最常见和最具破坏性的原发性颅脑肿瘤,其起源于大脑和脊髓内的神经胶质细胞。目前,胶质瘤的临床治疗方法主要是手术切除联合化学疗法和放射疗法。此外免疫疗法也越来越受到关注,其中包括包括靶向治疗,常用的药物有贝伐单抗,吉非替尼和CAR-T细胞疗法。恶性神经胶质瘤以多形胶质母细胞瘤（GBM）最具有侵袭性,高转移性,这些都是患者预后不良的主要原因。据报道,GBM可以表现出高程度的血管增生和内皮细胞增生。而血管形成与它们的生物学行为,恶性程度和临床复发直接相关,与患者的术后生存成反比。尽管治疗方法不断进步,患者预后有了显着改善,但总体治疗策略仍缺乏突破。因此,寻找神经胶质瘤新的治疗方法仍是研究的重点与难点。microRNA是长度大约为21至23个碱基的非编码RNA,可参与细胞增殖,凋亡及迁移等生理过程,其也与血浆代谢,细胞分化,肿瘤发生和发展密切相关。众多研究证实,microRNAs具有非常强大的生物学功能,可调控约40%m RNA,可作为抑癌基因或着癌基因,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。随着研究进展,越来越多的miRNA被证实在肿瘤的早期诊断及治疗中扮演着重要的角色。既往研究显示,miR-623主要功能是保护心肌和拮抗细胞凋亡的作用。miR-623已经验证的靶基因主要包括MMP1,CDK6,CCND1,XRCC5,GPRC5A等。其可以靶向周期蛋白对肿瘤细胞的周期产生影响,并且还可以调节经典的PI3K/AKT通路从而发挥重要作用。已有报道miR-623在乳腺癌,肺癌,肝癌,胰腺癌和食管癌等多种癌症的发生发展过程中发挥作用。多数研究认为,miR-623具有抑癌作用,其可能在不同肿瘤中调控的信号通路不尽相同,而且在不同肿瘤发生发展过程中的作用各不相同。因此miR-623在恶性肿瘤中的作用和机制有待深入研究。然而对于miR-623在神经胶质瘤的表达、功能和调控机制尚不清楚。上皮间质转化（EMT）是指上皮来源的肿瘤细胞的转化过程,这些细胞被剥夺了极性并获得了间质表型。EMT是上皮细胞获得迁移能力的有效途径,并且在恶性肿瘤的侵袭和转移中起着重要作用。miRNA在调控EMT的侵袭和进展方面引起了广泛的关注。本研究通过中国脑胶质瘤基因组图谱数据库（CGGA）进行分析,发现miR-623在胶质瘤中低表达,并与患者的预后有关,采用逆转录实时定量聚合酶链反应（Quantitative real-time reverse transcription-poly-merase chain reaction,qRT-PCR）技术在人脑星型胶质正常细胞株HEB细胞和三株胶质瘤细胞U87,U251,LN229中检测miR-623的表达情况,并设计miR-623的模拟类似物,对胶质瘤细胞进行转染,采用MTS-way法、Transwell小室实验、集落形成实验,研究miR-623对胶质瘤细胞株LN229和U251的增殖活力、集落形成能力和侵袭迁移等生物学功能的影响,并且通过蛋白免疫印迹（Western-blot）实验验证miR-623与上皮间质转化途径的关系,通过三个生物信息学网站,分析预测miR-623下游调控的靶基因。利用双荧光素酶报告基因分析检测miR-623对下游预测靶基因TRIM44的靶向作用,采用qRT-PCR和Western-blot检测转染miR-623的mimics后胶质瘤细胞株LN229和U251中预测靶基因TRIM44 m RNA与蛋白表达变化,进一步明确miR-623对靶基因的调控作用,在胶质瘤细胞株LN229和U251验证miR-623的靶基因TRIM44的生物学功能及对胶质瘤细胞恶性表型的影响。主要研究内容和结果如下:第一部分miR-623在CGGA数据库中筛选及在胶质瘤中的表达情况目的:为探寻神经胶质瘤（glioblastomas,GBM）的潜在的预测标志物及其是否与生存预后相关,本实验通过CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）数据库,比较了低级别神经胶质瘤和高级别神经胶质瘤的microRNA（miRNA）表达谱变化,寻找差异表达基因,并对其生存预后进行分析。方法:1.通过整合分析CGGA数据库,对WHOII,WHOIII及WHOIV级神经胶质瘤的差异表达miRNA进行聚类分析。2.寻找差异表达基因miR-623,探讨数据库中miR-623在神经胶质瘤组织中的表达情况。3.通过qRT-PCR技术,检测miR-623在正常神经细胞和恶性神经细胞中的表达量。4.通过整合CGGA数据库的临床数据,分析miR-623与神经胶质瘤患者的IDH突变是否有关,及分析miR-623是否与患者生存预后相关。5.通过分析CGG数据库,对miR-623表达量、患者性别及年龄等临床特征进行Cox多因素生存分析。结果:1.CGGA数据库显示,共有198名神经胶质瘤患者,其中WHOII级神经胶质瘤患者60名,WHOIII神经胶质瘤患者47名,WHOIV级神经胶质瘤患者91名。三者之间有众多的差异表达miRNA。我们共得到了123个差异表达基因（WHOIV,WHOIII和WHOII相比,表达倍数>2或<0.5,P<0.05）。我们对这些miRNA进行了聚类分析。2.GEO数据库中数据集GSE90603显示,相对于正常的神经组织,miR-623在神经胶质瘤组织中呈低表达（P=0.0012）。CGGA数据库显示,相对于WHOII级神经胶质瘤患者,miR-623在WHOIII和WHOIV级神经胶质瘤患者中呈低表达（P=0.0417,P<0.001）。相对于WHOIII级神经胶质瘤患者,miR-623在WHOIV级神经胶质瘤患者中呈低表达（P=0.0387）。3.qRT-PCR结果显示,相对于人正常的神经细胞HEB,miR-623在恶性胶质瘤细胞（U87MG,LN229,U251MG）中呈显著低表达（P<0.05）。4.CGGA数据库显示,miR-623在IDH突变的神经胶质瘤患者中呈高表达（P=0.0799）。通过对miR-623的表达量及患者的生存预后分析发现,相对于miR-623高表达的患者,miR-623低表达的患者生存预后更差,差别具有统计学意义（P<0.0001）;对于原发性神经胶质瘤患者来说,miR-623低表达的患者生存预后更差,差别具有统计学意义（P=0.0002）;对于复发神经胶质瘤患者来说,miR-623低表达的患者生存预后更差（P=0.07）。5.多因素Cox生存分析结果显示,患者的临床病理分级及化疗与患者的生存预后相关。小结:相对于正常神经组织,miR-623在神经胶质瘤组织中呈低表达。相对于低级别神经胶质瘤组织,miR-623在高级别神经胶质瘤组织中呈低表达。经qRT-PCR检测验证,相对于正常神经胶质瘤细胞,miR-623在恶性神经胶质瘤细胞中呈低表达。相对于miR-623高表达的患者,miR-623低表达的患者生存预后更差。miR-623是否具有生物学功能还需进一步研究。第二部分miR-623对胶质瘤细胞的恶性表型和上皮间质转化的影响目的:通过转染miR-623的模拟物,使miR-623在胶质瘤细胞LN229和U251中的表达量升高,来探讨其对胶质瘤细胞生物学行为和上皮间质转化途径的影响及作用机制。方法:将miR-623的mimics转染至胶质瘤细胞LN229和U251中。实验分为两组:miR-623mimics组、miR-623NC组。qRT-PCR检测miR-623的表达水平,MTS-way、集落形成实验和Transwell小室实验检测miR-623对胶质瘤细胞LN229和U251生物学行为的影响,蛋白免疫印迹实验检测胶质瘤细胞上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin表达水平,以及检测MMP2,MMP9表达水平,分析miR-623对胶质瘤细胞上皮间质转化途径的影响。结果:1.本研究通过Lipofectamine（?）2000转染试剂将miR-623的mimics转染胶质瘤细胞LN229和U251后。通过qRT-PCR技术检测结果表明胶质瘤细胞LN229和U251中,与miR-623 NC组相比,miR-623 mimics组miR-623的表达水平明显升高（P<0.05）。结果证明转染成功,为后续相关实验提供基础。2.MTS-way实验结果显示,转染24小时,48小时,72小时和96小时后对细胞的增值能力进行检测,发现miR-623mimics组较miR-623 NC组的细胞增殖能力明显降低（P<0.05）。3.集落形成实验结果显示,转染24小时后,进行集落形成实验,14天后固定后染色,miR-623mimics组较miR-623 NC组,细胞集落形成能力明显降低（P<0.05）。4.Transwell小室实验结果显示,转染24小时后,进行侵袭和迁移实验,观察穿过小室底部细胞数量,miR-623mimics组较miR-623 NC组,细胞侵袭和迁移能力明显降低,通过小室底部细胞数明显减少（P<0.05）。小结:1.miR-623具有抑制胶质瘤细胞LN229和U251增殖的作用。2.miR-623具有抑制胶质瘤细胞LN229和U251集落形成与侵袭迁移的作用。3.miR-623可以影响胶质瘤细胞的上皮间质转化途径。第三部分miR-623通过靶向TRIM44影响胶质瘤细胞的恶性表型及上皮间质转化目的:预测验证miR-623靶基因TRIM44的调控作用,明确miR-623通过靶向TRIM44对胶质瘤细胞生物学行为及上皮间质转化途径的影响。方法:在TargetScan,miDIP和miRDB生物信息学网站进行预测和筛选,根据文献及miR-623对胶质瘤细胞增殖功能的影响,筛选可能的作用靶序列。通过双荧光素酶报告基因分析的方法检测miR-623对筛选出候选靶基因靶向作用;采用qRT-PCR和Western-blot实验检测转染miR-623mimics的胶质瘤细胞株LN229和U251中候选靶基因TRIM44的表达变化,进一步验证miR-623与靶基因TRIM44表达的关系。设计TRIM44的si RNA,在胶质瘤细胞株LN229和U251进行转染,qRT-PCR检测细胞TRIM44的m RNA表达水平,Western-blot检测胶质瘤细胞TRIM44的蛋白表达水平,进一步验证转染效率。验证胶质瘤细胞中敲低TRIM44的表达,对细胞增殖及集落形成等恶性表型的影响。接下来进行回复实验,进一步分析miR-623是否通过调节TRIM44的表达影响胶质瘤的恶性表型,miR-623 mimics和NC阴性对照与TRIM44过表达载体和对照空载体共转染胶质瘤细胞,实验分为3组,分别为:miR-623 NC组,miR-623mimics+p ENTER vector组,miR-623 mimics+p ENTER-TRIM44组。通过MTS-way实验检测细胞增殖,Transwell小室实验检测细胞侵袭、迁移能力,蛋白免疫印迹检测细胞上皮间质转化相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达水平,验证miR-623靶向TRIM44影响胶质瘤细胞的恶性表型及上皮间质转化的分子机制。结果:1.在Target Scan,mi DIP和miRDB三个生物信息学网站进行预测和筛选出候选靶基因TRIM44,通过在胶质瘤中转染miR-623 mimics,蛋白免疫印迹检测TRIM44表达量降低,证明miR-623可以影响TRIM44的表达。2.荧光素酶报告基因分析显示,在胶质瘤细胞中,与UTR+miR-623mimics NC组相比,UTR+miR-623 mimics组,荧光素酶活性明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。而UTR（mutant）+miR-623 mimics组与UTR+miR-623 mimics NC对照组荧光素酶活性均无明显差异（P>0.05）,进一步证明miR-623可以靶向结合TRIM44。3.本研究通过Lipofectamine（?）2000转染试剂将TRIM44的si RNA转染胶质瘤细胞LN229和U251后。蛋白免疫印迹实验检测结果表明胶质瘤细胞LN229和U251中,与NC组相比,TRIM44-si RNA组TRIM44的表达水平明显降低。结果证明转染成功,接下来其在胶质瘤细胞表型实验显示,敲降TRIM44后胶质瘤细胞的增殖能力与集落形成能力明显降低（P<0.05）,进一步验证TRIM44也可以影响胶质瘤细胞的生物学表型。4.miR-623 mimics或其对照与TRIM44过表达载体或对照空载体共转染胶质瘤细胞后,MTS-way结果显示在24小时、48小时、72小时和96小时,与miR-623 NC+vector组相比,miR-623NC+p ENTER-TRIM44组LN229和U251细胞的增殖活力均明显升高（P<0.05）,miR-623mimics+vector组胶质瘤细胞增殖能力明显降低（P<0.05）。miR-623+vector组相比,miR-623mimics+TRIM44组LN229和U251细胞的增殖活力明显升高（P<0.05）。且miR-623 mimics+p ENTER-TRIM44组增殖活力介其他两组之间,通过回复实验进一步证明miR-623可以靶向调控TRIM44的表达,从而来影响细胞的功能。5.miR-623 mimics或其对照与TRIM44过表达载体或对照空载体共转染胶质瘤细胞后,Transwell小室实验显示,与miR-623 NC+vector组相比,miR-623NC+p ENTER-TRIM44组LN229和U251细胞的穿过小室底部的细胞数均明显增多（P<0.05）,miR-623 mimics+vector组胶质瘤细胞穿过小室底部的细胞数明显降低（P<0.05）。与miR-623+vector组相比,miR-623mimics+TRIM44组LN229和U251穿过小室底部的细胞数明显增多（P<0.05）。且miR-623 mimics+p ENTER-TRIM44组增殖活力介其他两组之间,通过回复实验进一步证明miR-623可以靶向调控TRIM44的表达,从而来影响细胞的功能。6.蛋白免疫印迹实验表明:与miR-623 NC组相比,miR-623 mimics+p ENTER vector组,E-cadherin表达水平明显升高,Vimentin、N-cadherin表达水平明显降低。接下来miR-623 mimics+p ENTER vector组与miR-623mimics+p ENTER-TRIM44组对比,E-cadherin表达水平明显降低,Vimentin、N-cadherin表达水平明显升高。加入的p ENTER-TRIM44质粒可以挽救miR-623 mimics对上皮间质转化相关蛋白的影响。小结:1.miR-623可以靶向调控TRIM44的表达。2.TRIM44可以影响胶质瘤细胞的恶性表型。3.miR-623可通过靶向抑制TRIM44的表达,调控胶质瘤细胞增殖能力及上皮间质转化途径。第四部分miR-623对胶质瘤细胞裸鼠移植瘤生长的影响及机制目的:检测miR-623对胶质瘤细胞在裸鼠体内的成瘤能力的影响,通过裸鼠荷瘤实验来探讨其在胶质瘤发生发展中的作用机制。方法:构建miR-623过表达质粒与对照载体稳转细胞系,进行稳转细胞株的筛选。筛选出的稳转细胞株进行qRT-PCR实验以检测miR-623m RNA的表达情况,进一步通过MTS-way和集落形成实验验证稳转细胞株的表型。将稳转细胞进行培养、传代和收集,将细胞注射到裸鼠皮下,建立裸鼠荷瘤模型。对荷瘤的裸鼠进行肿瘤体积的测量。4周后,脱颈法猝死裸鼠,将每只动物解剖,分离出各个脏器,观察的肿瘤大小并拍照,剥除各个肿瘤,记录数据。通过qRT-PCR检测裸鼠肿瘤中miR-623 m RNA表达平,蛋白免疫印迹法检测裸鼠肿瘤TRIM44和上皮间质转化相关蛋白的表达水平,进一步分析miR-623对胶质瘤细胞在动物体内增殖的影响。结果:1.稳转胶质瘤细胞在增殖活力与集落形成能力上与瞬时转染结果相同,进一步证明稳转细胞建立有效性。2.miR-623组裸鼠成瘤与对照组相比,肿瘤数目,体积和重量明显减少（P<0.05）。3.RT-PCR实验结果显示,与对照组相比,miR-623过表达组m RNA水平明显高于对照组（P<0.05）,并且miR-623过表达组TRIM44 m RNA水平明显低于对照组（P<0.05）。4.蛋白免疫印迹实验显示:miR-623组裸鼠肿瘤组织中TRIM44表达水平明显下降,与对照组相比上皮间质转化相关蛋白E-cadherin蛋白表达水平明显增加,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平明显降低。小结:体内实验证明miR-623可以抑制裸鼠体内移植瘤的生长。总而言之,miR-623在胶质瘤患者中低表达并且与生存密切相关,miR-623通过靶向作用于TRIM44 3’UTR抑制胶质瘤细胞的体内外增殖活力,同时抑制上皮间质转化途径的发生,miR-623有望成为胶质瘤治疗的新的靶点。