随着精准医疗、基因测试、法医鉴定、环境检测等研究领域的迅速发展,实现对病原蛋白和特定序列DNA的快速、灵敏、简单的痕量分析越来越重要。基于DNA的电化学生物传感器由于轻巧便宜、能耗少、灵敏度高和易于微型化等优势引起了广泛的关注,成为当今生化分析、转化医学等交叉领域的前沿性课题。核酸分子体外等温扩增技术是分子生物学领域常用的一种研究方法。DNA电化学生物传感器利用电化学检测的高灵敏性,与各种可再生策略和信号放大策略相结合,可以实现对痕量靶标的灵敏检测。本文围绕DNA电化学生物传感器研究的关键问题,即如何快速制备稳定、高活性的传感界面,如何构建信号重现、可再生的新型器件、如何进行信号放大实现对靶标高灵敏的检测等问题,制备了一系列新型DNA电化学生物传感器,并将其应用于生化分析中。以DNA探针为平台,结合DNA链置换反应、生物酶催化、聚鸟嘌呤纳米线等技术,在发展DNA电化学生物传感检测方面做了以下工作:1.基于低pH和高盐浓度缓冲用于金固相界面快速组装单链DNA探针实现单链DNA(ssDNA)探针在传感界面上的快速、稳定、简单的组装,可以有力推动DNA电化学传感器临床检测、现场诊断等方面的实际应用。本章中,利用低pH高盐浓度方法实现了ssDNA在金电极表面的快速固定化,探针组装过程可以在30分钟之内完成,且不会影响DNA探针的杂交活性。更深入的探讨了固定机理,通过电化学阻抗图谱计算出ssDNA探针在电极表面的覆盖度和反应的吉布斯自由能,说明低pH高盐浓度方法是通过化学吸附,即共价键结合的方式将ssDNA固定在金电极表面。pH和盐浓度均会影响固定化进程,两者存在协同作用。这种方法相比于传统方法(生理pH缓冲)操作更加简便、快速,对不同长度DNA片段均可以作用,具有较好的普适性。因此,该方法适用于构建各种基于DNA的电化学传感器,在快速制备dna传感芯片等领域有较强的潜在应用价值。2.基于dna链置换反应和锁核酸技术构建可再生dna电化学传感器用于检测单核苷酸多态性近年来,单核苷酸多态性(snp)的灵敏检测一直是基因诊断研究中的重要课题。本章报道了一种基于锁核酸修饰技术和dna链置换反应构建的可再生电化学传感器,并将其用于p53基因273位点单碱基突变的灵敏检测。此类传感器件可以通过监测电流信号on和off的状态判断目标物存在与否。当电流信号由on转变为off时,电极表面由于目标物的存在发生了dna链置换反应。当有其他干扰序列存在时,电流信号不变,体系依旧保持on的状态。把lna和sdr技术引入到检测体系中,提高了链置换反应的速率和传感器检测的效果。此外,本章构建的传感器具有优异的选择性和稳定性,在污染缓冲和高倍数鱼精基因组中仍然可以实现对目标基因的检测。同时,实验过程中无生物酶的参与,不需要复杂的仪器操作和精密的温度控制。因此,这个新设计的dna电化学传感器对于目标dna分子的检测不仅具有较好的灵敏度,而且具有优异的选择性和可再生性,在未来的生物芯片设计中具有良好的应用前景。3.基于i-motif构象转换构建可再生dna电化学传感器用于检测葡萄糖和尿素以i-motif结构为基础开展了广泛研究,如拓扑性质、ph传感、纳米机器等。然而,利用i-motif结构作为传感器元件,探讨在生物检测方向的应用少有报道。本章通过利用富含胞嘧啶的dna探针在不同ph值下的构象转变,发展了一种新型简单且无标记的电化学方法,用于检测葡萄糖和尿素。通过葡萄糖氧化酶和脲酶的生物催化反应实现反应溶液ph值的调节,进而调节富含胞嘧啶的dna探针在单链构象和i-motif构象之间的转变。通过电化学阻抗的方法可以实现对构象转变的表征,利用电化学阻抗值的变化可以实现对目标物葡萄糖和尿素的检测。由于酶催化的优异特异性,使此传感器具有较高的选择性,其他生物分子干扰物不影响目标物的检测。此外,此传感器还具有较高的可再生性能和稳定性,具有较强的潜在应用价值。4.基于聚鸟嘌呤纳米线信号放大灵敏检测核酸片段近年来,许多信号放大测试策略已被报道用于构建灵敏的电学、光学等传感平台,实现对核酸、蛋白等生物分子的检测。但大多数检测方法具有贵重的温控仪器、复杂的实验步骤、耗时长等缺点。因此,开发简便易行、快速灵敏的新型信号放大策略具有十分重要的意义。本章中利用富含g碱基的c-mycdna序列,在钾离子存在下形成具有TMB催化活性的G-四链体,继续加入镁离子后形成一系列具有TMB催化活性的聚鸟嘌呤纳米线(G-wire)。我们将此现象作为信号放大方式应用于金电极上灵敏检测DNA片段。把巯基修饰的c-myc序列连接在金电极上,加入游离的c-myc序列和镁离子,利用计时电流法和电化学阻抗法均检测到TMB催化信号的增强。随后,利用目标DNA打开发卡结构探针,使c-myc序列暴露,形成G-wire后进行信号放大检测,最低可检出15 pM。此方法不需要生物酶的参与,避免了复杂的温控过程,可以在室温下进行。与其他方法相比,该方法在灵敏度、线性范围上具有优点,有望满足基本的复杂样品检测需求。5.基于聚鸟嘌呤纳米线信号放大灵敏检测凝血酶凝血酶的活性及含量可以作为衡量凝血机制的关键指标之一,它对相关疾病的早期诊断、治疗及愈后判断具有非常重大的意义。建立快速、准确、简便、高灵敏的分析检测策略和传感装置用于凝血酶的定量分析在化学、生物、医学等领域中十分必要。本章以聚鸟嘌呤纳米线为信号放大结构构筑了免标记型的电化学传感器用于灵敏检测凝血酶。目标蛋白凝血酶可以与电极上的适配体和溶液中的L-DNA同时结合形成夹心结构,将L-DNA组装到电极上,在游离的c-myc和镁离子的存在下引发G-wire的生成。在测试底液TMB和H2O2中,聚鸟嘌呤纳米线与hemin结合形成具有TMB催化功能的DNA酶串联体,对TMB的催化反应电流起到了明显的增强作用,从而有效地提高了电极灵敏度。实验结果表明,该电化学适体传感器制备方法简单、稳定性好、具有较高的选择性和灵敏度,将其用于临床模拟样品的分析检测得到了令人满意的结果。6.聚肾上腺素荧光有机量子点的合成及其重金属离子检测应用荧光有机纳米材料因具有低毒、较好的生物相容性、功能性可调等优点,被认为在生物成像和疾病标志物诊断等领域具有较好的应用前景。本章通过“一锅煮”的简便合成方法合成了发绿色荧光的聚肾上腺素荧光有机量子点。这种荧光材料具有较好的水溶性、光稳定性和生物相容性。Fe2+、Fe3+、Cu2+的加入可以猝灭其荧光。经过NaF的前处理,调节反应时间,根据荧光信号的变化可以区分三种金属离子。实验进一步证明,本章中提出的PEP-FODs具有较好的细胞成像效果,可以用于胞内检测金属离子,有望作为一种新型荧光探针应用生化分析和生物成像。