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前言 补体系统是由30多种性质不同的液相或细胞膜蛋白组成的多分子系统，可通过经典途径和旁路替代途径激活，被激活后可直接或间接地介导组织损伤。Czurko等用免疫组化方法证实，大鼠脑缺血后1—3天，缺血中心区出现IgG浸润、局部C3免疫活性增强。1999年Watanabe等发现大鼠急性脊髓损伤(acute spinal cordinjury，ASCI)后3—24小时，损伤组织中未饱和C3R小胶脂细胞明显减少，表明C3R短期内被iC3b所饱和，提示补体系统参与了继发性脊髓损伤。但补体系统在损伤脊髓组织中的分布情况、经时变化以及作用机制还有待于进一步研究。如能明确补体系统激活在ASCI中的作用机制，则为ASCI的抗补体治疗提供了理论依据。 实验材料 一．实验动物及分组 健康SD大鼠80只，由中国医科大学实验动物部提供，雌雄不拘，体重250-300克，随机分组：(A)正常对照组n=5；(B)假手术组：分单纯椎板切除术后12h、1d、3d、5d、7d五个时间点，每个时间点n=5；(C)生理盐水(NS)组：分脊髓损伤后12h、1d、3d、5d、7d五个时间点，每个时间点n=5，伤后1h尾静脉注射生理盐水0.5ml，日一次；(D)sCR1组：分脊髓损伤后12h、1d、3d、5d、7d五个时间点，每个时间点n=5，伤后1h尾静脉注射sCR1(6mg/kg，溶于0.5ml生理盐水)，日一次。 二．主要试剂 1．兔抗大鼠CgJ鼠抗大鼠CD59抗体 2．重组可溶性补体受体1型卜） 3．SABC试剂盒 三．主要仪器 1．改良 Alien’s打击器（自制） 2．冰冻切片机 3·OlymPus BX60光学显微镜 4．CoolsnaPfr数码图像采集卡、PIV主机 5·Meta Morph全自动真彩色图像分析仪 实 验 方 法 一．动物模型制备 参照改良的Alien’s重物打击法制备大鼠脊髓背侧损伤模型：损伤部位为u 节段，致伤力为 50gCInf，假手术组仅行 T10全椎板切除，不损伤脊髓。 二．取材、冰冻切片制备及组织细胞学染色 各组动物分别于伤后12h上 j ＊d再次麻醉，以伤处为中心取 Icm脊髓组织，取损伤段冰冻切片机连续切片，分别行 y染色、尼氏染色及Cg人D59兔疫组化染色（SABC法人 三．观察指标及统计学分析： 二．光学显微镜下观察各组损伤脊髓组织变性坏死情况。 2．光学显微镜下人 及CD59阳性反应物为突出背景的棕黄色颗粒，观察其沉积、分布情况。 3．光学显微镜下，每组选取6张切片，分另计数5个高倍视野中性粒细胞数目。 4．图像分析：每组选取6张Cg免疫组化染色片，每张切片分 ·2·别从灰质前角至后角取5个高倍视野，测定Cg阳性反应物灰度阈值面积（Thrshold AIea，TA）和平均灰度值（Av－ gay yalue，AG人所有数据均用平均值。标准差（工。S）表示，应用SPSS10．0．统计分析软件，各时间点组间首先行方差齐性检验，然后行t或t’检验，P＜0．05为有显著性差异。 实 验 结 果 一．组织细胞学染色结果 二．正常对照组及假手术组 光镜下HE染色显示脊髓组织形态结构正常；尼氏染色显示神经元胞浆内有斑块状染色的尼氏小体；兔疫组化染色各时间点均未见 Cg及 CD59阳性反应物沉积。 2．NS组及 SCRI 组 门脊髓损伤后12h：＊S组灰质内有片状出血，损伤组织中有中性粒细胞浸润，神经元细胞肿胀。胞核偏位，尼氏染色斑块颜色变浅；脊髓前角部分神经元细胞膜上及胞浆内有散在Cg及CD59阳性颗粒沉积，这些神经元形态尚正常；SCRI组 y及尼氏染色表现基本与NS组相似，免疫组化染色见少量Cg及CD59阳性颗粒沉积。 2）损伤后 id必S组神经元细胞明显肿胀而变成圆形，灰质内有大量中性粒细胞浸润；尼氏染色斑块崩解为颗粒状；在脊髓前角神经元细胞膜上及胞浆内可见较多Cg及CD59阳性颗粒沉积，灰质的神经纤维网中亦可见Cg及CD59阳性颗粒沉积。SCRI组显示神经元细胞肿胀变性、中性粒细胞浸润及水肿带较NS组均轻，神经元细胞膜及胞浆内Cg阳性颗粒沉积量与NS组相比减少，但神经元细胞膜、胞浆内及神经纤维网中CD59阳性颗粒沉积量却无明显减少。 ·3· 3）损伤后 3 dJS组大量神经元崩解为不定形物，残存神经元固缩，可见核浓缩、核碎裂；灰质内有较多中性粒细胞浸润；残存神经元内尼氏小体颜色明显变浅，且数量减少；整个灰质和白质内均有大量Cg及CD59阳性颗粒沉积，其中残存阳性神经元的细胞膜及胞浆内均可见Cg及CD59阳性颗粒沉积，神经纤维网中CD59阳性颗粒沉积量明显增加。与NS组相比，SCRI组残存神经元较多，中性粒细胞浸润程度明显减轻；残存神经元内尼氏小体颜色相对较深，数量较多。灰质和白质内Cg阳性颗粒沉积量为轻，其中残存阳性神经元的胞膜及胞浆内及神经纤维网中CD59阳性颗粒沉积无明显减少。 4）损伤后 5 dJS组残存神经元继续减少，灰质内仍有一定数量中性粒细胞浸润，整个灰质内有仍有较多Cg及CD59