研究背景肌肉慢性损伤后会出现大量胶原沉积和脂肪浸润的退行性改变,纤维化和脂肪变性导致肌肉再生能力受到明显影响,引起肌肉力量不足、肌纤维萎缩。肩袖慢性损伤是骨科及运动医学中常见的肌肉-肌腱慢性损伤,中度到重度肩袖撕裂往往伴有明显的脂肪化和纤维化过程,导致肌肉组织弹性及强度严重下降,手术修复效果差,容易出现手术失败和术后再撕裂。因此,抑制肌肉慢性损伤后的退行性改变是目前骨科和运动医学的研究热点。目前认为成纤维/成脂前体细胞(FAP)是导致肌肉慢性损伤后脂肪浸润和纤维化的主要细胞来源,其具有双向分化能力,能够在体内分化为脂肪细胞和肌成纤维细胞。有趣的是,FAP细胞具有“双刃剑”作用,在急性损伤环境中,FAP细胞能够促进肌肉卫星细胞增殖并分化为肌管,帮助肌肉再生。在退变环境中,FAP细胞会不断累积并分化为脂肪细胞和肌成纤维细胞,导致肌肉退变发生。由此可见,如何保留FAP细胞促进肌肉再生的能力,同时尽可能抑制其异常分化是解决肌肉慢性损伤后退行性变的关键。研究发现,FAP细胞的细胞行为主要是受到周围微环境的影响,将FAP细胞从慢性损伤环境和急性损伤环境分别提取出来并互相移植后,FAP细胞会表现出新环境影响下的细胞特点,由此可见,微环境是调控FAP细胞命运的关键因素。肌肉是一种内分泌器官,肌纤维在收缩过程中可合成多种因子,统称为“肌肉因子”。这些肌肉因子可通过自分泌、旁分泌以及分泌入血的方式调控靶器官的生物学功能。肌肉组织内有丰富的肌肉因子表达,形成了肌肉因子微环境。肌肉因子对脂代谢、细胞的分化和增殖等方面具有重要的调控作用。研究表明肌肉因子对肌纤维自身的再生具有促进作用,但具体机制尚未完全清楚。我们推测在肌肉慢性损伤后,由于肌纤维萎缩等情况的发生,可能会显著影响组织局部肌肉因子表达谱的改变,而这些肌肉因子表达水平的改变可能参与了对慢性损伤后肌肉脂肪变性和纤维化的退变过程进而对肌肉的修复产生影响。因此,在本课题中,我们首先筛查了慢性损伤后脂肪浸润出现时肌肉因子的表达变化,发现IL-15的表达水平明显变化,然后我们进一步发现IL-15对FAP细胞增殖、分化具有显著影响,阐述了分子调控机制以及对肌肉脂肪变性和纤维变性的影响。我们的研究将有助于进一步阐释肌肉慢性损伤后脂肪变性和纤维化的病理机制,并有助于找到新的可能的治疗靶点。研究目的1.筛查肌肉脂肪变性后肌肉因子的变化情况。2.IL-15对FAP细胞成脂分化及肌肉脂肪浸润的影响及调控机制。3.IL-15对FAP细胞增殖及肌肉纤维化的影响及调控机制。4.IL-15对肌肉慢性损伤后修复的影响。5.研究人肩袖慢性损伤组织中IL-15表达情况与病理变化的相关性研究方法1.筛查肌肉脂肪变性后肌肉因子的变化情况构建小鼠甘油诱导的胫骨前肌肌肉慢性损伤模型,收集肌肉组织标本进行冰冻切片,采用组化染色法观察不同时间点肌肉损伤情况以及脂肪浸润情况,确定开始出现脂肪浸润的时间点。然后收集对应时间点的肌肉慢性损伤组织标本,通过实时定量PCR检测比较常见肌肉因子的表达变化情况,筛查出明显变化的肌肉因子。2.IL-15对FAP细胞成脂分化及肌肉脂肪浸润的影响及调控机制。通过FACS分选出肌肉原代FAP细胞进行体外成脂分化诱导,并用IL-15进行干预,采用油红O染色法观察IL-15对FAP细胞成脂分化的影响;构建肌肉慢性损伤模型,体内注射IL-15重组蛋白构建过表达模型并收集标本,采用免疫荧光组化法观察该肌肉因子对肌肉慢性损伤后脂肪浸润的影响;采用RT-PCR法检测干预后FAP细胞成脂信号通路的变化情况。3.IL-15对FAP细胞增殖及肌肉纤维化的影响及调控机制通过FACS分选肌肉原代FAP细胞进行体外培养并用IL-15刺激,采用CCK-8法观察刺激后FAP细胞的活性,BrdU法观察FAP细胞的增殖情况,用流式细胞计数法检测该肌肉因子对FAP细胞凋亡的影响;然后体内构建肌肉慢性损伤模型,注射IL-15重组蛋白进行干预,观察体内FAP细胞Ki67的表达;采用Western Blot法检测IL-15刺激后FAP细胞内增殖相关通路的改变情况,并抑制此通路,验证此通路对FAP细胞增殖的调控影响;然后构建CTX诱导的肌肉急性损伤模型和甘油诱导的慢性损伤模型,采用荧光免疫组化检测该肌肉因子干预后损伤区域纤维化的严重程度。4.研究IL-15对肌肉慢性损伤后修复的影响构建肌肉慢性损伤模型并用IL-15重组蛋白干预,收集标本制作冰冻切片,用免疫荧光组化法观察肌管横截面积的变化情况以及肌管中细胞核的数目和分布情况,评估该肌肉因子干预后对肌肉再生的影响。5.研究人肩袖慢性损伤组织中该肌肉因子表达情况与病理变化的相关收集人肩袖慢性损伤肌肉组织标本,制作冰冻切片后采用免疫荧光组化法检测病变组织中FAP细胞的数目、纤维化和脂肪化的程度;提取RNA后采用RT-PCR法检测IL-15的表达变化情况;通过统计学方法分析该肌肉因子表达水平与FAP细胞数量和纤维化程度的相关性。研究结果1.IL-15在小鼠肌肉慢性损伤脂肪浸润后的表达下降组化染色检测发现肌肉慢性损伤后第3天肌肉大量萎缩,7天有明显的肌管再生,同时在损伤后第7天开始出现明显的脂肪细胞浸润。RT-PCR比较了第7天和第0天(对照组)的肌肉因子mRNA水平,发现IL-15表达明显下降。提示IL-15可能参与了肌肉慢性损伤后脂肪变性的调控。2.IL-15抑制FAP细胞的成脂分化并缓解体内的脂肪浸润过程油红O染色发现IL-15能够在体外抑制原代肌肉FAP细胞的成脂分化,RT-PCR检测结果显示成脂标志物C/ebpα、Pparγ和Fabp4的mRNA表达水平显著降低。在体内注射IL-15重组蛋白后,免疫荧光组化法检测发现肌肉的脂肪浸润过程明显缓解,实时荧光定量PCR检测结果显示IL-15干预后肌肉组织内Dhh和Timp3的mRNA表达水平显著增高。说明IL-15能直接抑制FAP细胞的成脂分化并缓解肌肉内的脂肪浸润过程,此调控机制与Hedgehog通路有关。3.IL-15激活FAP细胞增殖并促进肌肉损伤后的早期纤维化通过体外CKK-8法和GFP-FAP细胞的体内移植模型检测发现IL-15能够促进FAP细胞的数量增加,BrdU法检测进一步证实IL-15促进FAP细胞的体外增殖,但对FAP细胞的凋亡没有影响。Western Blot检测结果显示IL-15干预后可激活JAK-STAT信号通路,抑制此通路后IL-15对FAP细胞增殖的促进作用受到抑制,同时在体内IL-15能够促进FAP细胞Ki67的表达,在体内抑制JAK-STAT通路后亦逆转了IL-15促进FAP细胞增殖的作用。然后采用免疫荧光法检测发现IL-15干预后肌肉急性和慢性损伤早期纤维化程度加重,RT-PCR法检测发现纤维标志物FN1和I型胶原的mRNA水平显著增高,抑制JAK-STAT通路可缓解胶原沉积和纤维标志物的表达。说明IL-15能够通过JAK-STAT通路促进FAP细胞的增殖并引起肌肉损伤后的早期纤维化。4.IL-15促进慢性损伤后的肌管再生免疫荧光组化结果显示IL-15干预后肌肉再生肌管的横截面积显著增加,同时多个核的肌管数目以及细胞核位于中央的肌管数目显著增多。说明IL-15能够促进肌肉慢性损伤后的肌管再生。5.IL-15与人慢性肩袖损伤肌肉中的FAP细胞数目和纤维化程度成正相关关系免疫荧光组化法检测发现人肩袖损伤后FAP细胞的数目会明显增多,胶原沉积加重,存在散在脂肪浸润;RT-PCR法检测在肩袖损伤组织中Il15基因的mRNA水平显著增高,通过统计学分析发现IL-15的表达水平与FAP细胞的数目以及纤维化程度成正相关关系。研究结论和意义本课题较为全面地阐述了IL-15对FAP细胞的调控作用以及对肌肉慢性损伤后退行性改变的影响。首先从体内和体外层面证明IL-15能够抑制FAP细胞的成脂分化和肌肉慢性损伤后的脂肪浸润,然后证明IL-15通过JAK-STAT通路促进FAP细胞的增殖,影响肌肉损伤早期的纤维化过程,同时IL-15对肌肉再生具有促进作用。最后在人肩袖慢性损伤组织中证实了IL-15与FAP细胞数目和纤维化程度的相关性。通过本研究,我们发现了对FAP细胞行为新的调控机制,以及对肌肉慢性损伤后脂肪浸润和纤维变性可能的新的治疗靶点,对肌肉慢性损伤后的再生修复提供了理论和实验支持。