基于LXR通路探讨QSHY方调节非酒精性脂肪肝甘油三酯和胆固醇代谢的机理

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目的:基于网络药理预测结果,以LXR通路为切入点,探讨QSHY方抑制非酒精性脂肪肝甘油三酯沉积的药理机制和调节胆固醇代谢的药效环节。方法:1.基于网络药理学方法,在已有数据库中检索QSHY方的已知有效化学成分,检索其有效化学成分的对应的靶标蛋白,进一步得到其靶标基因,同时检索NAFLD的疾病背景基因,分别去除重复后取二者的交集,得到其基因的相互作用网络,并在DAVID及IPA数据平台对这些基因进行GO和KEGG pathway的分析,得到预测的QSHY方治疗NAFLD的通路。2.1)建立肝细胞TG沉积体外模型(以LXR激动剂GW3965诱导Hep G2细胞TG沉积),观察QSHY方对TG沉积、细胞油红o染色及细胞DNL基因LXR、SREBP1c的m RNA及蛋白表达水平(RT-PCR、western blotting检测)的影响。2.2)建立高脂饮食、高糖饮水(HFHSD)诱导的NAFLD小鼠模型,将32只小鼠按随机原则分为正常、模型、QSHY方、PUFA共4组。造模14w,第15w开始,用药组以QSHY方及PUFA灌胃,正常组、模型组以等量饮用水灌胃。灌胃治疗共6w后取材。观察小鼠肝组织病理变化(HE,油红O染色)、血清ALT,肝脏甘油三酯(TG)含量,以及肝组织LXR、SREBP1c的基因m RNA及蛋白表达水平(RT-PCR、western blotting)。3.1)建立肝细胞CHO沉积体外模型(使用胆固醇造模),观察对QSHY方对CHO沉积以及细胞SREBF2、ABCG5、ABCG8等基因m RNA和蛋白表达水平(RT-PCR,western blotting)的影响。3.2)小鼠NAFLD模型同上。分别检测小鼠血清、粪便肝脏游离胆固醇FC、总胆固醇TC水平,肝组织冰冻切片总游离胆固醇(FILIPIN染色),肝组织SREBF2、CYP7A1、ABCG5、ABCG8等胆固醇生成及转运的m RNA及蛋白表达(RT-PCR,western blotting)。结果:1.基于网络药理学方法,预测到QSHY方治疗NAFLD的信号通路的前10条为急性期反应信号,HIV1诱导细胞凋亡,神经炎症信号通路,肝纤维化/肝星状细胞激活,LXR/RXR激活,FXR/RXR激活,Myc介导的细胞凋亡信号,细胞凋亡信号,内质网应激通路,IL-6信号。2.在体外实验中,QSHY方显著降低了LXR激动剂GW3965诱导的Hep G2细胞的TG沉积,抑制了LXR靶基因SREBP-1c的m RNA表达,同时QSHY方显著抑制了LXR蛋白及其下游蛋白SREBP-1c的表达。在体内实验中,QSHY方显著降低了实验性NAFLD模型肝LXR及其靶基因SREBP-1c的m RNA水平,减少肝脏TG蓄积;同时QSHY方降低NAFLD小鼠血清ALT水平,并降低肝脏炎症因子如TNF、IL6的表达。3.体外实验模型发现QSHY方显著减轻了体外胆固醇诱导的细胞内游离胆固醇的增加,抑制了胆固醇合成蛋白SREBF2的表达。体内实验发现在肝脏中,QSHY方显著抑制CYP7A1的表达,降低了肝脏CHO-胆汁酸(TBA)的转化,增加胆固醇转运体ABCG5/ABCG8的表达,增加肝脏CHO排泄;在小肠中,抑制NPC1L1的表达,减少小肠CHO的吸收,增加ABCG5的蛋白表达,促进小肠CHO排泄,增加了粪便CHO的排出,降低体内CHO蓄积。结论:1.QSHY方通过抑制肝脏LXR的表达,降低下游脂质生成相关靶标SREBP1的基因及蛋白的表达,抑制肝脏甘油三酯生成,改善肝脏脂肪变性。2.QSHY方通过减少胆固醇的生成、降低胆固醇吸收,增加胆固醇的经粪便排泄,降低肝脏胆固醇水平。
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