近二十年来，小肠移植已从实验阶段发展成为肠衰竭患者最为理想的临床标准治疗方式。随着器官获取及保存技术的改进、新型免疫抑制剂的应用、手术技巧的改进、急性排斥及危重感染的有效防治，小肠移植手术成功率及短期存活率显著提高。全球先进的移植中心报道小肠移植术后病人1年和2年的生存率可达90％和80％。南京军区南京总医院普通外科研究所作为国内最大的小肠移植中心，小肠移植已逐步成熟应用于临床。然而患者长期生存率未有明显改善，5年生存率仍低于50％，慢性排斥反应已成为远期移植肠功能丧失及死亡的主要原因。　　移植动脉硬化是器官移植慢性排斥反应的主要组织学病变，亦是导致移植物失功的重要因素，表现为血管内膜增厚、血管平滑肌增生、间质纤维化及炎性细胞浸润。研究发现超过50％患者于移植术后第五年出现移植血管硬化，其发病机制远未清楚。冷缺血时间、再灌注损伤、供受体间主要组织相容性复合物的差异及急性排斥反应发生均是移植动脉病变的高危因素。　　高脂血症常发生于器官移植术后，高胆固醇血症和脂质代谢异常可能致使慢性移植物失功。心脏移植患者术后高脂血症的发生率高达60％-80％，致使移植物血管病变风险增加，最终影响患者的长期生存。研究发现高胆固醇血症可能是导致心脏移植患者术后血管病变的重要因素。80％的肾脏移植患者术后出现长期脂质代谢紊乱，其中77％患者主要表现为血中胆固醇含量明显升高。他汀类药物通过抑制胆固醇合成酶能显著降低肾移植患者血脂含量，但仍有33％-41％病人呈现高胆固醇血症，给予依泽替米贝能有效的降低这些对他汀类药物耐受患者的血清胆固醇水平，其作用靶点是肠腔胆固醇关键转运蛋白Niemann-Pick C1 Like1(NPC1L1)。研究认为移植过程中缺血诱导内皮损伤致使移植物血管病变发生，高脂血症及其它危险因素可能加速血管病变进展。尸检发现移植的冠状动脉内胆固醇的含量是正常血管的10倍，临床数据表明胆固醇含量的高低与移植动脉硬化的发生率及病变程度呈正相关。高胆固醇血症可以加速血管病变发展，最终致使移植物慢性失功。　　肠道胆固醇吸收是体内胆固醇代谢的关键步骤，NPC1L1是肠道胆固醇的核心转运蛋白。NPC1L1的表达受到一些核因子受的调控，如肝脏X受体(LXR)。LXR在脂质代谢紊乱及动脉粥样硬化发病中均起重要作用，选择性LXR激动剂可以预防和抑制AS发生发展。　　鱼油富含n-3多不饱和脂肪酸，因其具有明显抑制炎症反应及免疫调节作用广泛的应用于AS与冠心病患者，改善血管功能。此外，鱼油也逐步应用于临床器官移植，在肾脏、心脏及肝脏移植中，鱼油可以降低血清脂质的含量，改善血流动力学，降低急性排斥反应的发生率，有利于移植器官的长期存活。然而，有关鱼油在大鼠小肠移植慢排模型中长期应用的相关研究很少，目前仅限于炎症反应及免疫改变方面，鱼油应用时间限于术后4月内。此外，缺乏对慢性排斥过程中胆固醇代谢、特别是移植肠胆固醇吸收变化的相关研究。　　目前小肠移植研究多采用大鼠异位小肠移植模型，原位小肠移植死亡率高，国外文献报道大鼠原位小肠移植慢排模型存活时间未达到术后半年，多为术后3月内。本试验的目的是建立大鼠原位小肠移植远期慢性排斥模型，观察慢性排斥反应病理特征及胆固醇吸收路径关键蛋白受体的改变，进而探讨长期鱼油应用（术后半年）调节胆固醇吸收和改善移植血管硬化的可能机制。　　第一部分大鼠原位小肠移植慢性排斥模型的建立　　研究1.1大鼠原位小肠移植模型的建立　　目的建立稳定可靠的大鼠原位小肠移植模型　　方法供受体早期均为雄性Sprague-Dawley大鼠，后期用近交系F344和Lewis分别作为供、受体，采用Murase建立的大鼠原位小肠移植模型，动脉吻合采用带腹主动脉补片的肠系膜上动脉端侧吻合于受体的肾下腹主动脉，静脉吻合采用门静脉端侧吻合于受体的下腔静脉，移植肠两端与受体肠均行端端吻合。　　结果共进行142次移植手术，后期手术成功率达到70％以上，手术时间约3小时左右，其中动脉吻合时间为18±5分钟，静脉吻合时间为11±4分钟，移植肠热缺血时间为30±6分钟。　　结论高质量的供肠获取、良好的血管吻合技术、有效循环容量的维持及术后及时复温是大鼠原位小肠移植成功的关键。　　研究1.2大鼠原位小肠移植慢性排斥模型的建立　　目的建立稳定可靠的大鼠原位小肠移植远期慢性排斥模型　　方法供受体分别为雄性近交系F344、Lewis大鼠，按照研究1.1建立的手术方法进行移植手术。实验分组:第一组:假手术组(n=8);第二组:ISO组(n=8):Lewis-to-Lewis;第三组:低剂量组(n=8):F344-to-Lewis，术后0-14、20、27天肌注他克莫司(FK506)0.3mg/kg/d;第四组:中剂量组(n=8):F344-to-Lewis，术后0-14、20、27天肌注他克莫司(FK506)0.5mg/kg/d;第五组:高剂量组(n=8):F344-to-Lewis，术后0-13、20、27天肌注他克莫司(FK506)1.0mg/kg/d。术后观察生存率及体重变化，并行组织病理学分析。　　结果 FK506高剂量组大鼠存活期达到半年，其它剂量组最长存活至18周。高剂量组体重增长曲线最接近ISO组，病理上表现中到重度的慢性排斥改变。　　结论术后0-13、20、27天肌注他克莫司(FK506)1.0mg/kg/d可以有效地建立大鼠原位小肠移植远期慢性排斥模型。　　研究1.3大鼠原位小肠移植慢性排斥移植肠组织学病变特征　　目的观察大鼠原位小肠移植慢性排斥模型移植肠组织学病变　　方法实验动物和移植手术同第一部分。实验分组:第一组:ISO组(n=8):Lewis-to-Lewis;第二组:PBS组(n=8):F344-to-Lewis，FK506同第一部分高剂量组。受体鼠于术后半年处死，观察移植肠大体变化。取相应的移植肠管、肝脏和肾脏用福尔马林固定，HE切片和Masson染色0-3分评价绒毛钝化、炎症细胞浸润、肌层和系膜纤维化，弹力纤维染色0-5分评估移植肠血管硬化。　　结果肉眼下ISO组移植肠色泽及结构均无明显异常，PBS组移植肠肠壁增厚僵硬，肠管颜色正常，系膜重度纤维化并呈乳白色改变，系膜明显缩短且系膜血管无法辨别，肠系膜与肠管间严重粘连。组织学示PBS组绒毛显著破坏、明显钝化，弹力纤维染色示移植血管内膜中到重度增生，Masson染色示系膜重度纤维性增生;ISO组以上指标无明显改变。极少数慢性排斥组大鼠肝脏存在少量的气球样变性和点状坏死，缺乏统计学意义，肾脏病理无异常。　　结论在我们建立的F344至Lewis大鼠原位小肠移植慢排模型中，系膜病变和内膜增生是主要的病变特征，该模型为研究移植血管硬化机制和相关药物奠定了基础。　　第二部分大鼠原位小肠移植慢性排斥模型肠道胆固醇吸收路径关键蛋白受体的改变　　目的观察慢性排斥模型中血清胆固醇含量变化，并探讨肠道NPC1L1及肝脏LXR的改变。　　方法实验动物和移植手术同第一部分。实验分组:第一组:ISO组(n=8):Lewis-to-Lewis;第二组:PBS组(n=8):F344-to-Lewis，FK506同第一部分高剂量组。于术后半年处死，生化检测血清胆固醇和甘油三酯含量，取部分移植空肠段及肝脏分别行NPC1L1和LXR mRNA检测(RT-PCR)。此外，另取部分移植空肠及肝脏分别行免疫组织化学和免疫荧光检测。　　结果 PBS组血清胆固醇含量明显高于ISO组，而甘油三酯含量无显著差异。RT-PCR结果示PBS组NPC1L1表达量明显高于ISO组，而LXR表达显著低于ISO组。免疫组化示NPC1L1高表达于PBS组移植肠上皮细胞，免疫荧光示ISO组肝脏高表达LXR。　　结论在大鼠原位小肠移植慢排模型中，LXR表达受抑制，肠道胆固醇转运蛋白NPC1L1表达上调，肠道胆固醇吸收增加，致使受体鼠发生高胆固醇血症，进而可能参与移植血管硬化的发生发展过程。　　第三部分 n-3多不饱和脂肪酸对大鼠原位小肠移植慢性排斥模型胆固醇吸收途径及移植血管硬化的调节作用　　目的观察鱼油对慢性排斥中胆固醇吸收途径及移植动脉硬化的调节作用。　　方法仍然采用F344-to-Lewis大鼠原位小肠移植慢性排斥模型，术后0-14、20、27天肌注FK506(1.0mg/kg/d)。实验分组:第一组:ISO组(n=8):Lewis-to-Lewis;第二组:PBS组(n=8):F344-to-Lewis;第三组:FO组(n=9):F344-to-Lewis;第四组:CO组(n=8):F344-to-Lewis。后两组术后分别按照0.6％V/W（ml/100g体重）FO和CO灌胃。术后半年处死，生化检测血清胆固醇和甘油三酯含量，分别取各组移植肠及肝脏用福尔马林固定，病理切片HE、Masson染色和弹力纤维染色评估各组组织学病变，并分别行免疫组化和免疫荧光检测肠道NPC1L1和LXR的表达。各组另取部分近端移植肠和肝脏分别行NPC1L1和LXR mRNA及蛋白检测(RT-PCR和Western-blot)。　　结果 FO组受体鼠体重增长速度显著高于PBS组和CO组。FO组血清胆固醇含量明显低于PBS组和CO组，甘油三酯含量各组无显著差异。大体上PBS组和CO组移植肠均显著增厚，系膜重度纤维化并明显挛缩，肠管间及肠管与系膜间严重粘连。FO组移植肠肠壁略有增厚，肠管间轻度粘连，少量系膜纤维化。组织学示FO组移植肠绒毛结构紊乱，粘膜固有层少量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，系膜轻度纤维性增生、血管内膜轻度增生。而PBS组和CO组示移植肠绒毛结构严重受损，大量脱落，肌层断裂，粘膜固有层大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，系膜重度纤维化，血管内膜显著增生甚至完全闭塞。RT-PCR及Western-blot均示FO组NPC1L1表达显著低于PBS组。FO组LXR表达显著高于PBS组和CO组，与ISO组相当。免疫组化示FO组NPC1L1的表达量明显低于PBS组，免疫荧光示FO组LXR表达量强于PBS组和CO组。　　结论在大鼠原位小肠移植慢排模型中，鱼油明显改善慢性排斥组织学病变，上调LXR表达，抑制NPC1L1的表达，减少肠道胆固醇吸收，进而显著降低血清胆固醇水平，可能是其减轻移植血管硬化的作用机制之一。