目前对于线粒体疾病并无有效的治疗方法,所以现在对线粒体疾病患者的主要治疗目的借助辅助生殖技术对致病线粒体DNA（mt DNA）的遗传进行阻断。主要的辅助生殖技术包括:供卵、植入前胚胎遗传学诊断和线粒体移植技术。由于供卵不能生育和母方有遗传关系的子一代,以及植入前胚胎遗传学诊断不能对mt DNA的比率和发病风险进行精确评估,限制了这俩种治疗方法在临床上的应用。因而,目前的研究主要集中于利用线粒体移植的方法对致病mt DNA的遗传进行阻断。遗传阻断的最理想情况是线粒体移植后的胞浆内不含有致病mt DNA.因此决定线粒体移植技术成功与否的关键点是致病mt DNA的携带率。而目前报道的移植后最低的致病mt DNA的携带率为2%,但通过培养线粒体移植后的囊胚形成的干细胞,仍能发现致病mt DNA比率上升的现象。线粒体自噬是细胞选择性降解mt DNA的主要方式,因此,本研究提出,能否利用线粒体自噬降低致病mt DNA的携带率?要研究这一问题,首先要清楚植入前胚胎中是否存在线粒体自噬,以及其发生的相关机制。而这一科学问题尚无相关的文献报道。因此,本论文将对植入前胚胎中线粒体自噬的发生及调控机制进行探讨。主要分为以下两个方面:第一部分:研究小鼠植入前胚胎中线粒体自噬的发生。第二部分:研究小鼠植入前胚胎中线粒体自噬发生的相关机制。第一部分:小鼠植入前胚胎中线粒体自噬的发生研究目的利用由双荧光（红色和绿色）标记的、锚定与线粒体的两种PH敏感性的探针:Mito QC-FIS1（锚定于线粒体外膜FIS1蛋白）和Matrix-Mito QC（锚定于线粒体基质蛋白ATP5B和COX8A）进行体外模型实验,并结合Mito QC小鼠进行体内模型实验,观察植入前胚胎（从双原核到囊胚阶段）中线粒体自噬的发生情况。为利用线粒体自噬降低线粒体移植技术中致病mt DNA的携带率提供理论基础。研究方法本部分实验将从体外和体内两方面来观测线粒体自噬的发生。其中体外实验主要包括以下几个方面:1.获取Black6小鼠原核时期胚胎.2.将锚定于线粒体的双荧光标记的PH敏感性探针:mito QC-FIS1(和matrixmito QC,分别显微注射到双原核时期的胚胎中.3.体外培养,利用共聚焦显微镜（相同的拍摄设置）对每个阶段的胚胎进行观察,观测线粒体自噬的发生情况.4.对步骤3中线粒体自噬发生阶段的胚胎进行溶酶体标记物（Lamp1）免疫荧光染色,检测代表线粒体自噬的单个红点是否位于溶酶体内。5.对步骤3中线粒体自噬发生前后的胚胎进行mt DNA拷贝数目分析,进一步验证线粒体自噬的发生。体内实验为利用合作实验室提供的线粒体自噬报告小鼠（mito QC小鼠）,对体外实验中观测到的线粒体自噬的发生情况进行验证,主要包括以下几个方面:1.获取mito QC小鼠的胚胎,不经体外培养,迅速利用共聚焦显微镜对其进行观察,检测线粒体自噬的发生情况。2.对步骤1中观测到的线粒体自噬发生阶段的胚胎进行Lamp1（溶酶体标记物）免疫荧光染色,检测代表线粒体自噬的单个红点是否位于溶酶体内。3.对步骤1中观测到的线粒体自噬发生阶段的胚胎进行mt DNA拷贝数目分析。研究结果体外实验结果:1.显微注射mito QC-FIS1和matrix-mito QC的两组实验中,都观察到了线粒体自噬发生在植入前胚胎的晚期阶段（八细胞、桑椹胚和囊胚）。2.通过比较mito QC-FIS1模型和matrix-mito QC模型,发现matrix-mito QC探针能更精确的反应线粒体自噬的发生。3.溶酶体标记物（Lamp1）免疫荧光结果显示代表线粒体自噬发生的单个红色荧光信号和位于溶酶体内,验证了mito Q-FIS1探针和matrix-mito QC探针的有效性。4.mt DNA拷贝数目定量分析发现,和八细胞阶段胚胎相比,囊胚阶段的mt DNA拷贝数目显著性减少,进一步支持了线粒体自噬的发生。体内实验结果:1.代表线粒体自噬发生的单个红色荧光信号开始出现于mito QC小鼠八细胞阶段的胚胎中,到囊胚阶段显著增多。2.溶酶体标记物（Lamp1）免疫荧光结果显示mito QC小鼠胚胎中代表线粒体自噬发生的单个红色荧光信号位于溶酶体内。3.mt DNA拷贝数目定量分析发现,和八细胞胚胎相比,囊胚阶段的mt DNA拷贝数目显著性减少,支持了mito QC小鼠胚胎中观测到的线粒体自噬的发生。结论本部分的体外和体内实验均观察到线粒体自噬发生于八细胞/桑椹胚和囊胚阶段,并且分别通过溶酶体标记物（lamp1）的免疫荧光染色和线粒体DNA拷贝数目定量分析进一步验证了线粒体自噬的发生。第二部分小鼠植入前胚胎中线粒体自噬发生的相关机制研究目的目前报道的线粒体自噬发生的相关机制主要有以下三种:Pink1-Parkin,Fundc1和Nix/Bnip3信号通路。但是目前还不清楚植入前胚胎发育中线粒体自噬的发生和哪种信号通路有关。因此,本部分的研究目的是探讨植入前胚胎发育过程中线粒体自噬发生的相关机制。研究方法1.参考Petropoulos等学者于2016年对人胚胎八细胞到囊胚进行RNA测序的测序结果,推测线粒体自噬相关蛋白从八细胞阶段到囊胚阶段的表达情况。2.通过步骤1的分析发现Nix/Bnip3相关蛋白转录组表达情况和我们第一部分发现的线粒体自噬的时间一致。提示该信号通路可能参与调控植入前胚胎的线粒体自噬的发生。首先利用免疫荧光的方法对这两种蛋白在植入前胚胎中和线粒体的位置关系。3.依据已发表的文献,Nix和BNIP3参与线粒体自噬是通过磷酸化的方式。设计野生型NIX m RNA/BNIP3 m RNA以及拟磷酸化的NIX m RNA和BNIP3m RNA。将这些探针分别和matrix-mito QC探针一起显微注射入原核时期胚胎,具体如下:实验组一为野生型NIX m RNA+matrix-mito QC探针,实验组二为拟磷酸化NIX m RNA+matrix-mito QC探针,实验组三为野生型BNIP3 m RNA+matrix-mito QC探针,实验组四为拟磷酸化BNIP3m RNA+matrix-mito QC探针,对照组为仅显微注射matrix-mito QC探针的胚胎。4.利用共聚焦显微镜（相同拍摄设置）分别对实验组和对照组各个时期胚胎中线粒体自噬的情况进行观察,比较实验组和对照组线粒体自噬水平的改变。5.比较实验组和对照组同一时期胚胎中mt DNA拷贝数目。6.设计NIX si RNA,利用免疫荧光的方法检测Nix si RNA敲减效率。7.将NIX si RNA+matrix-mito QC一起显微注射到原核时期胚胎中,以matrixmito QC注射组为对照组,观察NIX si RNA注射后的线粒体自噬发生情况。实验结果1.依据Petropoulus团队的RNA测序结果分析发现,BNIP3和NIX的基因表达情况和本实验第一部分发现的线粒体自噬的发生阶段一致。2.BNIP3免疫荧光结果显示:从二细胞到八细胞阶段,BNIP3均位于细胞核内,从桑椹胚时期开始出现在细胞质内,并且和线粒体共定位。NIX免疫荧光结果显示:从二细胞到囊胚时期,NIX均位于细胞质内,但二细胞阶段到八细胞阶段,只是小部分NIX和线粒体共定位,而从桑椹胚阶段到囊胚,大部分的NIX和线粒体共定位。3.和对照组相比,野生型NIX m RNA+matrix-mito QC探针（实验组一）和拟磷酸化NIX m RNA+matrix-mito QC探针（实验组二）显微注射后的胚胎,都能观察到更多的线粒体自噬的发生。而这一现象在实验组二表现的更为明显。4.和对照组相比,实验组一和实验组二囊胚阶段的mt DNA拷贝数目均显著减少,其中以实验组二囊胚mt DNA拷贝数目减少的最为明显。5.和对照组相比,并未观察到实验组三和四中线粒体自噬水平的明显改变。6.NIX si RNA显微注射后NIX的免疫荧光结果显示,和未注射NIX si RNA的对照组相比,可以有效地敲减NIX的荧光信号。7.和matrix-mito QC显微注射的对照组相比,NIX si RNA注射组可以明显地减少囊胚期的线粒体自噬的发生。结论NIX参与植入前胚胎发育过程中线粒体自噬的发生,并且NIX 34位点35位点丝氨酸磷酸化会诱导更多线粒体自噬的发生。