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牙周炎是细菌引起的炎性疾病,成年人的牙齿松动脱落大部分是由患牙周炎所致。牙周炎常规的治疗是对治疗局部病原因素,通过龈上、龈下洁刮治及根面平整等基础治疗和辅助药物、激光治疗的方法来控制临床炎症,甚者通过引导骨/组织再生等手术方式来希望达到牙周缺损有效的恢复。但是,临床发现通过这些方法让牙周软硬组织实现再生疗效是有限的。因此,努力获得满意的牙周骨缺损修复和牙周组织功能的重建,是目前大家进行大量研究的目标。而近年来组织工程技术迅猛发展,并逐渐应用在口腔疾病研究中,利用干细胞、生长因子和三维支架材料的结合,为牙周软、硬组织的再生提供了新的可能性。牙囊干细胞（Dental follicle stem cells,DFCs）来源于包裹在成釉器和牙乳头周围的牙囊组织,最终发育成牙周的支持组织。研究证实DFCs自我更新能力和体内、外多向分化能力较强,已有学者成功诱导DFCs分化成成骨细胞、成神经细胞和成脂肪细胞。作为牙周组织的前体细胞,DFCs用作牙周组织工程干细胞有一定优势,深入研究必将为临床干细胞移植等技术的突破提供更多可能。骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）是调节骨骼发育和重塑的蛋白。在14种具有促成骨潜能的BMPs中,骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）有着最强的成骨诱导作用,BMP9作为牙周骨再生的生长因子应用于牙周组织工程中将大大提高成骨效果。牙周炎患者的牙周组织是处于具有炎症的微环境中,炎症会导致组织发生一系列改变而无法获得正常的再生修复能力,所以致力于炎症微环境来研究干细胞的生物学特性,才能了解其在更接近于实际环境下的功能改变。肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）是牙周炎组织中检测到的最主要的炎症因子之一,能导致牙槽骨吸收和胶原纤维的破坏。因此,TNF-α在牙周环境的炎性变化中起着了不可忽视的作用。我们前期实验证明BMP9能诱导大鼠牙囊干细胞（rat dental follicle stem cells,rDFCs）成骨向分化,但炎症微环境对BMP9诱导rDFCs成骨向分化的影响尚不清楚。干细胞的分化过程处于复杂的信号通路调控网络。而炎症微环境下,rDFCs在成骨分化过程中涉及的信号调控机制尚未阐明,阻碍了应用组织工程技术治疗牙周炎骨缺损等新技术的发展。已有研究证实Wnt信号通路在骨的发育以及骨的再生过程中不可或缺。而也有研究表明Wnt信号通路对不同干细胞在不同环境中的调控是不尽相同的。目前对于在炎症环境下,Wnt信号通路对BMP9细胞因子诱导rDFCs成骨过程的作用尚未见报道,本课题将对其进行初步研究。目的:1.体外培养获取纯化的rDFCs,构建重组腺病毒骨形成蛋白9（recombinant adenoviruses expressing BMP9,AdBMP9）感染的rDFCs细胞模型。2.探讨TNF-α构建的炎症微环境对BMP9诱导rDFCs的成骨分化的影响。3.探讨在炎症微环境下Wnt信号通路在BMP9诱导rDFCs成骨分化过程中的作用。方法:第一部分:取6 d大的SD大鼠下颌磨牙胚的牙囊组织,利用酶消化法和组织块法获取原代rDFCs,差速传代法纯化r DFCs。AdBMP9感染纯化的第3代rDFCs,于24 h、48 h观察绿色荧光表达。第二部分:分别用不同浓度的TNF-α（0、2.5、5、10、50 ng/ml）刺激rDFCs,在1 d、3 d、5 d、7 d进行CCK-8检测来观察rDFCs增殖活性以选取合适的TNF-α浓度作为后续实验的刺激浓度。为了探究rDFCs在炎症因子刺激后是否具有炎症特性,以TNF-α（10 ng/m L）刺激rDFCs,通过ELISA方法检测干预24 h再常规培养72 h后,rDFCs组、rDFCs+AdBMP9组、rDFCs+TNF-α组、rDFCs+AdBMP9+TNF-α组的TNF-α分泌情况。为了明确TNF-α构建的炎症微环境对BMP9诱导rDFCs成骨分化的影响,按以下分组rDFCs组、rDFCs+AdBMP9组、rDFCs+TNF-α组、rDFCs+AdBMP9+TNF-α组对细胞进行成骨诱导,成骨诱导7 d后碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色观察早期成骨,成骨诱导14 d后,茜素红S染色检测钙盐沉积观察晚期成骨情况。最后利用Real Time-qPCR（RT-qPCR）检测细胞成骨基因Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,RUNX2）,骨钙素（osteocalcin,OCN）,I型胶原（type 1 collagen,COL-1）,ALP的表达水平。第三部分:为了探究炎症微环境下Wnt信号通路在rDFCs经BMP9诱导后的成骨分化过程中的作用,将r DFCs组、rDFCs+AdBMP9组、rDFCs+TNF-α组、rDFCs+AdBMP9+TNF-α组四组成骨诱导7 d后提取全蛋白,Western Blot实验检测Wnt经典信号通路关键蛋白β-catenin,糖元合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）和非经典信号通路关键因子Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKII)与Nemo样激酶（nemo-like kinase,NLK）的表达水平,同时RT-qPCR检测Wnt经典信号通路下游靶基因Cyclin D1的表达情况。结果:第一部分:构建AdBMP9感染的rDFCs细胞模型1.成功获得纯化的第3代rDFCs,以长梭形为主。本课题组前期实验已成功鉴定rDFCs。2.AdBMP9感染rDFCs后,rDFCs稳定表达绿色荧光。第二部分:探讨TNF-α构建的炎症微环境对BMP9诱导的rDFCs成骨分化的影响。1.高浓度TNF-α（50 ng/ml）降低rDFCs增殖活性呈时间依赖性,故为保证细胞活性,选取10 ng/ml作为刺激浓度。ELISA检测,与没有炎症因子刺激对照组比较,TNF-α（10 ng/ml）刺激组rDFCs的TNF-α分泌合成量增加。2.AdBMP9诱导组,与没有AdBMP9诱导对照组比较,ALP染色更深,钙盐沉积更多,成骨因子RUNX2,OCN,COL-1,ALP表达水平更高,但TNF-α刺激组与没有TNF-α刺激对照组比较,ALP染色变浅,钙盐沉积减少,RUNX2,OCN,COL-1,ALP表达水平降低。第三部分:探讨在炎症微环境下Wnt信号通路在BMP9诱导rDFCs成骨分化过程中的作用。1.Western Blot结果提示,TNF-α模拟的炎症微环境导致β-catenin表达水平升高,可降解β-catenin的GSK3-β表达量低于无炎症因子刺激对照组。RT-q PCR结果显示Wnt经典信号通路的下游靶基因Cyclin D1的表达水平上升。2.Wnt非经典信号通路的关键蛋白CaMKII,NLK在有TNF-α刺激组低于无刺激对照组。结论:TNF-α刺激后的rDFCs具有炎症特性。模拟的炎症环境抑制了rDFCs在BMP9诱导下的成骨分化,这个过程中Wnt经典信号通路被激活,而非经典信号通路被抑制,这是引起r DFCs成骨能力下降的关键原因之一。可见Wnt/β-catenin通路和Wnt/Ca2+通路在rDFCs的成骨分化过程中都有着它们各自重要的作用,当它们的之间所处的动态平衡被打破,就会影响干细胞的功能,这为后续实验通过调控Wnt信号通路来恢复干细胞功能提供了理论基础。