2型糖尿病是一种复杂的内分泌代谢疾病，其以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌不足引起的以持续性血糖升高为特征，临床上表现三多一少，即多饮、多食、多尿和体重减少。随着社会经济的发展，生活水平的改变，糖尿病的发病率正逐年升高，其已成为继恶性肿瘤，心脑血管疾病后的第三位严重危害人类健康的重大疾病。有效的对糖尿病进行防控是全人类面临的重大难题。　　 由于该病的发生发展与遗传因素和环境因素均有密切关系，其发病机制目前尚未明确。因此，开展2型糖尿病相关分子致病机制的研究对2型糖尿病尤其是其并发症的早期预防、早期诊断、早期治疗具有重大的指导意义。　　 线粒体DNA突变及功能缺陷与2型糖尿病发病密切相关。线粒体的位点突变会导致线粒体结构、功能和基因表达的改变，与线粒体生物能量合成和能量代谢的缺陷密切相关;而线粒体单体群的不同提示在不同遗传背景下，个体患2型糖尿病的风险不同，可能是2型糖尿病患病的分子基础。虽然已有的研究发现线粒体DNA变异及单体群与2型糖尿病发病相关，相关突变位点包括:A3243G，T16189C，C1310T等;相关单体群包括:N9a，D4，B4等。但目前，在不同单体群的遗传背景下，线粒体基因变异与2型糖尿病发病相关研究还未见报道。　　 因此，本研究以T2DM线粒体单体群及基因变异为切入点，通过建立浙江省汉族人群2型糖尿病及对照样本标准化资源库和数据库，了解中国浙江温州地区汉族人群2型糖尿病线粒体突变相关易感和保护基因及其常见突变方式，探讨2型糖尿病易感的单体群及相关基因变异的分子致病机制，并在此基础上，联合分析2型糖尿病线粒体单体群的不同遗传背景和相关基因变异的相互作用，尤其是罕见变异和单次变异对T2DM的发病影响，为临床上2型糖尿病及其并发症的预警、诊断和治疗提供科学的理论依据和技术指导。本研究主要分为以下两部分内容:　　 第一部分浙江省2型糖尿病与对照样本的标准化资源库建设　　 此部分研究旨在建立覆盖浙江省全省的2型糖尿病与对照样本标准化资源库，该标准化资源库包含以下具体内容:①受试者知情同意书;②受试者（及其家属）基本资料表等;③受试者（及其家属）入院资料、体格检查结果、检验相关指标等临床资料;④受试者（及其家属）外周静脉全血样本;⑤受试者（及其家属）全基因组DNA样本;⑥受试者（及其家属）基因检测结果;⑦部分重点家系的永生细胞株。目前为止，该资源库共纳入2型糖尿病患者4586例，非糖尿病对照2247例。　　 利用建立的2型糖尿病标准化资源库，对现有2型糖尿病患者临床发病情况、并发症情况、遗传方式以及基因变异进行初步地分析。这些工作的完成不仅仅可以永久保存宝贵的糖尿病遗传资源，为今后进一步深入开展科研及临床工作奠定了良好的基础。同时，也为2型糖尿病及并发症的遗传危险因素评估提供理论依据，尤其是为筛查出的线粒体糖尿病患者及其家属提供遗传咨询、婚配指导和疾病预警的相关建议，实现2型糖尿病的早期诊断、干预和治疗，有效降低T2DM的并发症的发生。　　 第二部分中国汉族人群线粒体单体群及基因变异与2型糖尿病的相关性研究　　 目的:　　 研究浙江温州地区汉族人群线粒体单体群、基因突变及其相互作用与2型糖尿病的关系　　 方法:　　 1.样本收集纳入:共纳入温州医学院附属第一医院内分泌科的汉族T2DM患者301例;非糖尿病对照组样本403例来自温州医学院附属第一医院体检中心。详细准确记录各组样本临床基本情况及相关指标。　　 2.基因扩增:通过提取受试者外周血基因组DNA，采用PCR技术扩增线粒体全基因组序列后，直接送公司测序。　　 3.序列比对分析:将测得的DNA序列与修正剑桥参考序列通过Condoncode Aligner软件进行比对，查找变异位点;再对变异后氨基酸的改变进行分析;并应用PolyPhen2网站对氨基酸改变对蛋白质功能影响预测分析，同时应用Clustal X软件分析氨基酸的保守性;另外，根据mtDNA变异位点，结合mtiomap网站和HaploGrep网站进行线粒体单体群分型。统计分析T2DM组与对照组中线粒体单体群的分布差异，及不同单体群中不同类型mtDNA变异在T2DM和对照组中的分布差异。统计学分析均采用SPSS16.0软件进行:计量资料采用t检验;计数资料采用x2检验和Fisher精确概率法检验。　　 结果;　　 1.本研究病例对照样本中，2型糖尿病组在BMI、收缩压、空腹血糖、低密度脂蛋白等指标水平均显著高于非糖尿病对照组，经t检验P值均小于0.05，有显著统计学差异。　　 2.本研究纳入人群单体群分布如下: D4(13.90％)、D5(8.19％)、M7(8.93％)、M8a(1.74％)、M9(2.23％)、M10(1.99％)、M12(0.50％)、G(2.73％)、C(3.72％)、Z(3.72％)、N9a(3.47％)、A(6.70％)、R9(16.63％)、R11(1.74％)、B(20.35％)和Y(0.74％)等为我国相对多见的单体群。其中M8a(OR=3.032;95％CI,1.215-7.563; P=0.013)、Z(OR=0.233;95％CI,0.066-0.820; P=0.014)和N9a(OR=2.388;95％CI,1.169-4.874; P=0.015)3种单体群在T2DM和对照组间的分布有统计学差异，提示M8a、Z和N9a这3种单体群可能与T2DM的发病风险密切相关。M8a和N9a患糖尿病的风险为其他单体群的3.032和2.388倍，为T2DM的易感人群;而Z患糖尿病的风险仅为其他单体群的0.233倍，降低了T2DM的患病风险。　　 3.线粒体基因组DNA经测序发现，在301例T2DM患者中，共检测到1169种变异，其中点突变1135种，缺失11种，插入23种。403例对照样本中，检测到1397种变异位点，其中点突变1353种，缺失12种，插入32种。经x2检验，T2DM组中的线粒体基因缺失率显著高于对照组，OR=1.255;95％CI,1.041-1.513; P=0.017，提示线粒体的基因缺失可能是T2DM的危险因素。　　 4.将T2DM组和对照组中所有的线粒体基因变异比较分析，x2检验发现，共有21个突变位点在2组中的分布具有显著统计学差异，其中包括20个点突变和1个基因缺失。包括位于线粒体基因D-loop、ND5、ATP6、COⅠ、ND6、COⅢ、ND2等基因变异523delAC(OR=3.308;95％CI,2.268-4.826; P=0.000)、T16519C(OR=2.604;95％CI,1.939-3.498; P=0.000)、G12372A(OR=2.481;95％CI,1.317-4.674; P=0.004)、C8684T(OR=3.176;95％CI,1.290-7.820;P=0.008)、G6179A(OR=3.176;95％CI,1.290-7.820; P=0.008)、G16473A(OR=5.474;95％CI,1.154-25.968; P=0.016)、C194T(OR=3.784;95％CI,1.193-12.001; P=0.016)、C16184T(OR=2.772;95％CI,1.170-6.565; P=0.016)、T14470C(OR=2.621;95％CI,1.152-5.963; P=0.017)、C12705T(OR=1.460;95％CI,1.070-1.991; P=0.017)、C9296T(OR=4.110;95％CI,1.103-15.312;P=0.023)、G5417A(OR=2.140;95％CI,1.097-4.176; P=0.023)、C8964T(OR=3.428;95％CI,1.065-11.037; P=0.028)、G8020A(OR=2.554;95％CI,1.006-6.480; P=0.041)和A4833G(OR=2.206;95％CI,0.987-4.933; P=0.049)等15个基因变异可能增加了T2DM的发病风险;而基因D-loop、CYB、COⅠ、ATP6上的T16271C(P=0.006)、T15784C(OR=0.162;95％CI,0.037-0.709;P=0.006)、C16185T(OR=0.258;95％CI,0.087-0.763;P=0.009)、A6752G(OR=0.229;95％CI,0.066-0.787; P=0.011)、T9090C(OR=0.280;95％CI,0.080-0.982; P=0.034)、C16291T(OR=0.389;95％CI,0.154-0.982; P=0.039)等6个变异则降低了T2DM的发病风险。上述位点仅有2个位点为错义突变，但保守性分析显示该2个位点保守性差。　　 5.在M单体群和N单体群中，线粒体上所有常见基因变异(MAF≥5％)在T2DM组和对照组中分布无差异，提示线粒体常见变异可能与T2DM的发病无关，仅为物种进化中的适应性SNP。　　 6.在M单体群下，T2DM组线粒体基因CytB、ND1和ND3的低频变异(1％≤MAF＜5％)少于对照组中的低频变异;而在N单体群中，T2DM组则是线粒体基因tRNA的低频变异少于对照组中的低频变异。　　 7.在M单体群下，T2DM组线粒体基因D-loop、CytB、ND5和COⅡ的罕见变异(MAF＜1％)显著高于对照组中的罕见变异，提示D-loop、CytB、ND5和COⅡ的罕见变异可能是2型糖尿病发病的危险因素;而N单体群下，T2DM组则是线粒体基因COⅡ和ND1的罕见变异显著高于对照组中，提示COⅡ和ND1的罕见变异可能是2型糖尿病发病的危险因素。　　 8.对比分析单体群M和N中单次变异（在所有样本中仅出现一次）的分布情况，各基因在M和N中的累计变异基本分布一致。但COⅢ的单次突变给N单体群人群增加了T2DM的患病风险，而非M单体群T2DM的危险因素;而CytB和COⅡ的单次变异与M单体群人群T2DM发病相关;ND4的单次变异则与N单体群人群T2DM发病相关。　　 9.统计罕见变异中的错义突变，T2DM组和对照组间无差异。分别针对各个编码基因进行分析，基因CytB（OR=2.225;95％CI，1.443-3.489; P=0.000）、ND5(OR=1.925;95％CI,1.122-3.303; P=0.016)和ATP6(OR=1.813;95％CI,1.041-3.159; P=0.034)中罕见错义突变在T2DM组显著高于对照组，可能增加了T2DM的患病风险;且发现ND1的L181M（2例）、ND4的N138S（2例）、ATP6的G16S（4例）和A177T（2例）这4种具有破坏效应的突变仅在T2DM组出现，且ATP6的G16有保守性好。　　 结论:　　 线粒体单体群为浙江温州地区汉族人群T2DM发病的分子基础，不同单体群背景联合不同mtDNA基因变异对T2DM发病的分子作用不同。且线粒体基因常见变异大多为SNP位点，罕见变异和单次变异可能才是线粒体基因变异影响T2DM发病风险的分子基础和关键所在。