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第一部分mTORC1和mTORC2蛋白在食管鳞癌组织中的表达及意义目的：检测mTORC1和nTORC2蛋白在人食管鳞癌组织中的表达情况,分析其与食管鳞癌临床病理特征之间的关系。为探索这一疾病发生的分子机制、寻找有效的治疗靶点提供实验依据。方法：58例人食管鳞癌样本经临床病理分级分期后,采用免疫组化方法检测癌组织中mTOR、mTORC1的关键蛋白Raptor、mTORC2的关键蛋白Rictor、以及p-Akt (Ser473)的表达情况,另选取25例正常食管粘膜组织作为对照。分析上述检测指标与食管鳞癌临床病理特征之间的关系,初步探讨mTORC1和mTORC2在该疾病发生、发展中的作用。结果：1.mTOR、mTORC1蛋白Raptor、mTORC2蛋白Rictor在人食管鳞癌组织中有不同程度的异常表达。癌组织中mTOR、Raptor以及Rictor的阳性表达显著高于正常黏膜组织(p值均<0.01),表明nTORC1和mTORC2可能与食管鳞癌的发生有关。同时,癌组织中p-Akt (Ser473)的表达水平与Rictor的表达水平呈正相关(r=0.440,p=0.001),表明在食管鳞癌中mTORC2参与了Akt的Ser473位点磷酸化。2.进一步分析显示,肿瘤分期晚、低分化的癌组织中Raptor的阳性表达率较相对应的分期较早、分化较好的癌组织显著升高(p值均<0.05)；而Rictor和p-Akt (Ser473)在肿瘤分期晚、有淋巴结转移的癌组织中阳性表达显著升高(p值均<0.05)。结论：1. mTORC1和mTORC2两个复合物的关键蛋白均在人食管鳞癌组织中异常高表达。mTORC2蛋白Rictor与Akt的Ser473位点活化正相关。2. mTORC1蛋白Raptor过表达与食管鳞癌分期较晚和分化低相关,mTORC2蛋白Rictor过表达与食管鳞癌分期较晚以及淋巴结转移相关。因此,mTORC1和1nTORC2的激活可能是这一疾病靶向干预治疗的重要靶点。第二部分抑制剂靶向干预mTORCl/2信号通路对食管鳞癌细胞生物学行为的影响目的：通过使用两类mTOR阻断药物：nTORC1变构抑制剂雷帕霉素(第一代mTOR抑制剂)和mTORC1/2激酶抑制剂PP242(第二代mTOR抑制剂),观察比较靶向抑制mTORC1或双重靶向抑制mTORC1/mTORC2对食管鳞癌细胞下游信号通路蛋白和生物学行为包括细胞增殖、克隆形成能力、凋亡以及周期分布的影响。从而进一步明确mTORC1和mTORC2在食管鳞癌中的作用,并为特异性的靶向mTORC1或mTORC1/2通路治疗这一疾病提供临床前的实验依据。方法：培养人食管鳞癌细胞Eca-109和TE-1。使用Western-blot方法检测两种细胞中mTOR及其下游底物蛋白P70S6K、4E-BP1、Akt的活化情况,以及经雷帕霉素和PP242处理后上述活化蛋白的表达改变。MTT方法检测不同浓度的雷帕霉素和nTORC1/2激酶抑制剂PP242和Ku-0063794对食管鳞癌细胞Eca-109和TE-1增殖的影响。克隆形成实验检测不同浓度的雷帕霉素和PP242对食管鳞癌细胞Eca-109和TE-1克隆形成的影响。流式细胞技术和Western Blot技术检测雷帕霉素和PP242对食管鳞癌细胞Eca-109和TE-1细胞周期分布和凋亡的影响。结果：1.mTOR及其活化形式p-mTOR在食管鳞癌细胞Eca-109和TE-1中均有表达,mTORC1下游底物蛋白p70S6K、4E-BP1及mTORC2下游底物蛋白Akt(Ser473位点)在两种细胞中均活化。雷帕霉素处理后,Eca-109和TE-1细胞中P-mTOR(Ser2448)和p-P70S6K(Thr389)的表达水平较对照组明显降低,而p-Akt(Ser473)与p-4E-BP1(Thr37/46)的水平较对照没有下降。PP242既能降低两种细胞中p-mTOR口p-p70S6K的表达水平,同时也能降低pAkt和P-4E-BP1的水平。2.雷帕霉素、PP242可以有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109和TE-1增殖以及克隆形成,其中PP242抑制效应较雷帕霉素明显。3.雷帕霉素、PP242均可诱导食管鳞癌细胞G0/G1周期阻滞,其中PP242作用更明显。4.PP242能显著增加两种细胞凋亡的数目,并增强活化状态的PARP(Cleaved-PARP)表达,雷帕霉素没有此作用。结论：1.mTORC1/2下游底物蛋白在食管鳞癌细胞中活化。双重mTORC1/2激酶抑制剂PP242对其下游信号通路有明显抑制作用,而mTORC1抑制剂雷帕霉素仅能阻断部分mTORC1的活性。2.雷帕霉素和PP242均可抑制食管鳞癌细胞增殖,降低克隆形成率,诱导周期阻滞,其中PP242效果更明显。PP242而不是雷帕霉素能够诱导食管鳞癌细胞凋亡。因此,靶向抑制mTOR信号通路在食管鳞癌中具有潜在的抗肿瘤效果,其中双重靶向mTORC1/2较靶向mTORC1信号通路可能有更大的优势。第三部分mTORCl/2信号通路抑制剂与顺铂在食管鳞癌细胞中的联合作用目的：顺铂是传统的化疗药物,有效的联合治疗在减轻其毒性反应的同时,还可能增强药物的疗效。本部分研究将观察顺铂单用或联合nTORC1/2靶向抑制剂对食管鳞癌细胞增殖、凋亡的影响。初步探讨顺铂和mTOR干预药物联合作用增效的可能机制。方法：培养人食管鳞癌细胞Eca-109,用不同浓度的顺铂单用或者联合雷帕霉素或PP242处理后,以MTT法检测不同药物单用和联合使用对Eca-109细胞增殖的抑制作用。流式细胞技术和Western Blot技术检测顺铂单用或者联合PP242对Eca-109细胞和TE-1细胞凋亡的影响。Western-Blot技术检测单药或联合用药对Eca-109细胞中Akt及其活化水平的影响。结果：1.顺铂抑制食管鳞癌细胞Eca-109增殖,并呈浓度依赖性。PP242与顺铂联合作用能够显著增加顺铂对Eca-109细胞的抑制作用,两者联合具有协同效应。2.PP242联合顺铂显著增强了单药诱导的Eca-109和TE-1细胞的凋亡(p<0.05)。3.顺铂单独作用后Akt的活化形式p-Akt(Ser473)升高,而与PP242联合作用后,p-Akt(Ser473)水平下降,提示PP242可能有效抑制了顺铂诱导的Akt磷酸化。结论：1.双重mTORC1/2抑制剂PP242与顺铂联合应用,能够增强顺铂对食管鳞癌细胞Eca-109的抑制作用,促进顺铂诱导的细胞凋亡。两者联合具有协同效应。2.PP242和顺铂协同作用的机制可能与PP242有效逆转顺铂诱导的Akt磷酸化有关。