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一.热疗对肺癌细胞生长的影响目的:观察相同时间内不同加热温度对人肺癌A549、H1299细胞生长周期及凋亡的影响,探讨热疗对表达不同状态P53基因肺癌细胞的促凋亡机制。方法:选取对数生长期的人肺癌A549、H1299细胞分为实验组(40℃、42℃、44℃加热组)和对照组(37℃加热组)。对照组:分别将人肺癌A549、H1299细胞装入离心管,37℃水浴放置2h;实验组:分别将人肺癌A549、H1299细胞放置入离心管中在40℃、42℃、44℃水浴中加热2h。上述细胞经过不同温度加热处理后继续置入37.0℃培养箱中培养24h。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分别检测不同温度的热疗对人肺癌A549、H1299细胞生长的抑制作用;流式细胞技术分别观察不同温度的热疗对人肺癌A549、H1299细胞生长周期及凋亡的影响;RT-PCR分别检测不同温度的热疗对人肺癌A549、H1299细胞凋亡相关基因P53、Caspase-3表达的影响。结果:①人肺癌A549细胞在加热至40℃、42℃、44℃维持2h后,细胞生长抑制率分别为:29.0%,47.6%,78.4%;人肺癌H1299细胞在加热至40℃、42℃、44℃维持2h后,细胞生长抑制率分别为:17.1%,32.2%,69.3%。可见,热疗对人肺癌A549、H1299两种细胞的生长均有抑制作用,随加热温度的升高两种细胞生长受抑制的程度越强,加热后A549细胞的生长抑制率明显高于H1299细胞。②人肺癌A549细胞在加热至37℃、40℃、42℃、44℃,各维持2h后,G0/G1期细胞的比例分别为:67.842±1.463%,62.173±1.324% , 52.871±0.539% , 54.983±1.217% ;凋亡率分别为:0.505±0.109%,5.812±1.356%,14.249±0.499%,10.315±1.162%。人肺癌H1299细胞在加热至37℃、40℃、42℃、44℃,各维持2h后,G0/G1期细胞的比例分别为:64.196±1.324%,64.743±0.979%,62.985±2.364%,63.623±1.657%;凋亡率为:0.593±0.247%,4.918±1.326%,10.454±0.473%,9.285±0.321%。可见,热疗可以明显改变人肺癌A549细胞生长周期的分布,G0/G1期细胞明显减少,并以42℃加热时G0/G1期细胞减少最为明显。但是,加热对人肺癌H1299细胞生长周期的分布影响不大。不同温度加热后A549细胞的凋亡率明显高于H1299细胞,并以42℃时凋亡率最高。③40℃、42℃、44℃的热疗后A549细胞P53蛋白的表达明显增强,并以42℃加热组P53蛋白的表达最为明显;加热并不能诱导H1299细胞P53蛋白的表达。然而,40℃、42℃、44℃的热疗能同时诱导A549、H1299两种细胞Caspase-3蛋白表达的增强,不同温度加热后A549细胞Caspase-3蛋白的表达均高于H1299细胞,并且以A549细胞、42℃加热组中Caspase-3蛋白的表达最强。结论:①热疗能明显抑制肺癌细胞的生长,并且随加热温度的升高细胞生长受抑制的程度增强。②热疗可以通过抑癌基因P53途径改变肺癌细胞的生长周期,使其阻滞在G0/G1期,并且最终通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡。③在肺癌细胞热疗过程中,以42℃加热2h对肺癌细胞生长周期及凋亡的影响最大。二.热疗对肺癌A549细胞免疫应答的影响目的:观察相同时间内不同加热温度对人肺癌A549细胞表面共刺激分子B7-H1(PD-L1)、B7-H3以及热休克蛋白HSP-70表达的影响,探讨共刺激分子B7-H3以及热休克蛋白HSP-70在热疗后的肿瘤免疫中可能发挥的作用。方法:选取对数生长期的人肺癌A549细胞分为实验组(40℃、42℃、44℃加热组)和对照组(37℃加热组)。对照组:将人肺癌A549细胞装入离心管,37℃水浴放置2h;实验组:将人肺癌A549细胞放置入离心管中在40℃、42℃、44℃水浴中加热2h。上述细胞经过不同温度加热处理后继续置入37.0℃培养箱中培养24h。采用流式细胞技术观察不同温度的热疗对人肺癌A549细胞表面PD-L1,B7-H3表达的影响;免疫组织化学方法检测不同温度加热处理后A549细胞中HSP-70的表达。结果:①人肺癌A549细胞在加热至37℃、40℃、42℃、44℃,各维持2h后,细胞中B7-H3的表达分别为:0.8%,90.7%,97.3%,86.0%;而人肺癌A549细胞在加热至37℃、40℃、42℃、44℃,各维持2h后,细胞中PD-L1的表达分别为:0.6%,0.6%,0.7%,0.9%,均为阴性表达。可见,热疗能够明显上调人肺癌A549细胞表面B7-H3的表达,并且以42℃加热组中B7-H3的表达量最高;但热疗不能改变A549细胞表面的PD-L1的表达。②37℃组HSP-70在A549细胞中呈阴性表达,40℃、42℃、44℃的热疗能够使A549细胞中的HSP-70呈阳性表达;并且以42℃加热组中HSP-70呈强阳性表达;在44℃加热组中HSP-70虽然也呈强阳性表达,但大部分细胞的细胞核固缩,细胞出现坏死。结论:①热疗能明显上调人肺癌A549细胞表面B7-H3的表达,使肿瘤细胞表面共刺激信号增强,以42℃加热2h肺癌细胞中B7-H3的表达量最多,共刺激信号增强最明显。②热疗能使人肺癌A549细胞中HSP-70呈阳性表达,增强了肿瘤细胞的免疫原性,在42℃、44℃加热2h后肺癌细胞中HSP-70均呈强阳性表达,但在44℃时A549细胞已经出现大量坏死,以42℃加热2h肺癌细胞免疫原性增强的效果最佳。