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猪与小鼠模型相比,不仅寿命长而且在解剖结构和生理机能等方面与人类十分接近,因此猪被认为是人类疾病和再生医学研究理想的动物模型。理论上,猪多能性干细胞可以模拟人类临床细胞治疗并对其安全性进行评价。目前没有建立真正的初始态(naive state)的猪胚胎干细胞系,这限制了其在临床医学、基因修饰等方面的应用。猪诱导多能干细胞(piPSCs)的获得给猪胚胎干细胞的研究带来了新的思路,可能成为猪胚胎干细胞良好的代替材料,在再生医学和细胞治疗以及猪分子育种等方面具有潜在的应用前景。目前建立的piPSCs不能通过胚胎注射获得生殖系嵌合体,piPSCs质量还有待进一步提高。其主要原因是没有合适的培养体系。优化现有的培养体系不仅有利于获得高质量的piPSCs,而且可为建立真正的猪胚胎干细胞奠定理论基础。诱导piPSCs培养体系主要借鉴小鼠胚胎干细胞(mESCs)和人胚胎干细胞(hESCs)的培养体系,然而这两类培养体系对piPSCs产生怎样的作用却研究甚少。本课题分别使用mESCs和hESCs培养体系建立了两类形态不同的piPSCs。来源于mESCs培养体系的piPSCs形态类似mESCs,称为mpiPSCs;来源于hESCs培养体系的piPSCs形态类似hESCs,称之为hpiPSCs。mpiPSCs与hpiPSCs之间存在的主要差异是:mpiPSCs与hpiPSCs表达不同的细胞表面标记,mpiPSCs表达SSEA-1,hpiPSCs表达SSEA-4、TRA-1-81和TRA-1-60;基因表达谱和信号通路抑制实验显示mpiPSCs依赖于JAK/STAT3和BMP信号通路,hpiPSCs依赖于FGF信号通路;mpiPSCs体外胚胎嵌合能力显著高于hpiPSCs;mpiPSCs细胞内存在明显的脂滴积累和结构不成熟的线粒体,hpiPSCs细胞内没有脂滴并且线粒体结构是成熟的。从基因表达和脂滴积累的情况来看,mpiPSCs更加类似于猪内细胞团(ICM)细胞。猪卵母细胞中存在大量脂滴,脂质代谢在猪早期胚胎发育时期出现明显上调,由此推测脂质可能有利于猪多能性干细胞的建立。本研究在mESCs培养体系的基础上加入脂质添加剂AlbuMAX可以显著提高piPSCs诱导效率。由此脂质培养体系获得的piPSCs(称之为LpiPSCs),其形态呈典型的mESCs克隆样,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达SSEA-1、OCT4、SOX2和NANOG等多能性标记。LpiPSCs在体外可以形成拟胚体,在免疫缺陷小鼠体内可以形成畸胎瘤,可以分化成三胚层类型细胞。LpiPSCs可以嵌合到猪孤雌囊胚的ICM中,同时又可以嵌合到小鼠早期胚胎当中,表明LpiPSCs具有一定的胚胎嵌合能力。转录组测序分析显示LpiPSCs中脂质代谢相关的基因出现显著的上调,类似于猪早期胚胎代谢特征。同时AlbuMAX的培养体系可以显著促进piPSCs增殖。本研究进一步发现AlbuMAX可以上调细胞内cAMP水平,激活cAMP/PKA/CREB信号通路,促进E-cadherin的表达,推动间质向上皮转化进程,最终提高重编程效率。综上所述,本研究发现培养体系可以影响piPSCs的基因表达和代谢特征。来源于mESCs培养体系的mpiPSCs更加类似于猪ICM细胞。通过在mESCs培养体系的基础上添加AlbuMAX可以促进piPSCs的诱导效率,促进piPSCs的增殖。本研究为进一步获得高质量的piPSCs和建立猪的胚胎干细胞提供了实验基础和理论依据。