【摘 要】
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目的探索Mycoplasma amphoriforme中与肺炎支原体P1黏附素最相似的毒力因子,并对其进行生物信息学分析、原核重组表达及纯化。方法1.Mycoplasma amphoriforme P1的生物信息学分析。以肺炎支原体P1黏附素在肺炎支原体基因组中所处的位置、氨基酸序列作为模板,从Mycoplasma amphoriforme基因组筛选出同源性最相似的Mycoplasma ampho
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目的探索Mycoplasma amphoriforme中与肺炎支原体P1黏附素最相似的毒力因子,并对其进行生物信息学分析、原核重组表达及纯化。方法1.Mycoplasma amphoriforme P1的生物信息学分析。以肺炎支原体P1黏附素在肺炎支原体基因组中所处的位置、氨基酸序列作为模板,从Mycoplasma amphoriforme基因组筛选出同源性最相似的Mycoplasma amphoriforme P1。通过在线软件,对Mycoplasma amphoriforme P1进行生物信息学分析,分析理化性质,预测信号肽、跨膜区、磷酸化位点以及二级结构、三级结构、结构域,并预测其抗原决定簇。2.MA-P1蛋白的重组表达、纯化。基于生物信息学分析的结果,将Mycoplasma amphoriforme P1进行截短并根据大肠杆菌表达特点及Ni柱亲和纯化特点将其优化（命名为MA-P1）,优化后的MA-P1基因序列外送公司合成。将合成的MA-P1基因进行PCR扩增,并亚克隆到原核表达载体p ET-30a中,构建原核重组质粒p ET-30a-MA-P1。该重组质粒转化E.coli BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western-Blot分析,最后通过Ni柱亲和层析法纯化得到目的蛋白。结果1.Mycoplasma amphoriforme的第184359-187322位基因所编码的蛋白,其蛋白编码为CDN40264.1,与肺炎支原体P1黏附素的位置、氨基酸序列相似度最高,将其命名为Mycoplasma amphoriforme P1。通过在线生物软件分析可知,Mycoplasma amphoriforme P1基因编码987 AA,分子质量约为107 k Da,理论等电点9.27,不稳定系数为29.59（<40）,亲水性总平均值为-0.219;存在信号肽的概率为24.64%;该蛋白在13-35、882-904位氨基酸之间分别形成一跨膜区;含有19个苏氨酸磷酸化位点,46个丝氨酸磷酸化位点和6个酪氨酸磷酸化位点。二级结构包括延伸链、α螺旋、β转角及无规则卷曲,所占比例分别为23.91%、19.66%、8.51%、47.92%;在660-668、716-725、958-971位氨基酸之间各形成一低复杂性的结构域,在96-151位氨基酸之间可能形成蛋白结构域;有33个抗原决定簇,平均抗原倾向为1.0160。2.基于生物信息学分析的结果,截短Mycoplasma amphoriforme P1第1-313位氨基酸作为目的蛋白,将其命名为MA-P1。MA-P1基因经过PCR扩增后与原核表达载体p ET-30a连接,构建重组质粒p ET-30a-MA-P1。经IPTG诱导表达含重组质粒p ET-30a-MA-P1的E.coli BL21（DE3）菌后,SDS-PAGE及WesternBlot分析表明,MA-P1重组蛋白分子质量约为35 k D,与预期目的蛋白分子量相符,蛋白表达正确。采用Ni柱亲和层析法来纯化MA-P1蛋白,得到终浓度为1.2mg/m L的目的蛋白。结论1.Mycoplasma amphoriforme P1为Mycoplasma amphoriforme的第184359-187322位基因所编码的蛋白,蛋白编码为CDN40264.1,与肺炎支原体P1黏附素的位置、氨基酸序列相似。2.将Mycoplasma amphoriforme P1通过在线生物软件进行分析,基于分析结果将其截短并初步优化,将其命名为MA-P1。3.重组载体p ET-30a-MA-P1构建成功,并能够在大肠杆菌表达系统中高效表达,通过Ni柱亲和层析法得到了纯度较高的目的蛋白,为后期Mycoplasma amphoriforme ELISA检测方法的建立提供原材料基础。
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