以1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、免疫反应小、携带的基因片段容量大和可整合进宿主基因组而长期表达等优点，因而成为最理想的基因转移载体之一。然而，慢病毒的随机性整合到靶细胞染色体中也会促使细胞基因组的一些功能基因被沉默或者引起原癌基因插入激活致细胞癌变等严重负面影响。非整合型慢病毒载体的应用不但避免了随机整合导致插入诱变致癌的危险，而且保持了慢病毒载体的其它优点。此外，在非整合慢病毒载体的基础上通过转座子引导的定点整合机制可以进一步改造成定点整合慢病毒载体。 现有的非整合型慢病毒载体都是通过突变整合酶蛋白本身的一些位点或者其识别的病毒长末端重复序列(longterminalrepeat，LTR)上的序列构建而成，存在很大的回复突变风险，且由于没有从根本上对载体进行修饰和改造，HIV同源序列仍然占非整合型慢病毒基因组的20％。因此，我们提出一个新的逆转录系统构想，对慢病毒的序列进行精减和重新排布，其中涉及到tRNALys引物初始结合位点(PrimerBindingSite，PBS)的位置改变。过去的研究表明慢病毒载体中PBS位点与核心包装信号相隔较近甚至PBS在整个病毒包装过程中是否起作用还不清楚。此外，由于HIV5’RNA.非翻译区存在复杂的空间结构，U5区上游序列和包装信号形成稳定二级结构对病毒包装起重要作用，而且U5区下游部分序列和PBS部分序列配对形成U5-PBS发卡结构参与逆转录的起始。因此，我们设计了PBS前四个碱基突变、PBS的18个碱基序列全部缺失和U5-PBS发卡结构序列缺失的三个载体质粒来研究PBS对病毒逆转录和病毒包装的影响。 该研究是在未经改造的慢病毒载体质粒pPGK-GFP基础上通过PCR、酶切、连接等分子生物学方法，经改造获得三个所需的目的慢病毒载体质粒(pPGK-GFP/G、pPGK-GFP/C、pPGK-GFP/D)。此后，利用磷酸钙转染法生产三个经改造的病毒和LvGFP阳性对照病毒。经不断摸索，增加质粒转染效率，最终用包装LvGFP病毒的细胞上清和纯化的病毒感染Hela细胞，能够观察到绿色荧光。实验显示LvGFP阳性对照病毒已成功包装，但是滴度较低，需进一步改进以提高病毒产量。其他三个经改造的病毒上清和纯化的病毒感染Hela细胞后没有观察到荧光。其原因有两：一是病毒已包装出来，但改造的部分对逆转录产生影响所以观察不到荧光；二是病毒没有包装。此两种原因需要进一步的实验验证。总之，我们所构建的三个经改造的慢病毒载体质粒为后续非整合慢病毒载体研究奠定了基础；以及所生产出的LvGFP病毒，尽管滴度低，但为后续慢病毒的生产奠定基础。