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研究背景:骨质疏松(OP)发病的病理机制为破骨细胞(OC)骨吸收的速率超过成骨细胞(OB)骨生成能力,从而导致负性骨平衡。人体骨骼持续不断地进行更新和重建,从而维持骨的新旧交替、保持骨骼强度的动态平衡。这一骨重建过程,依赖于OC的骨吸收和OB的骨形成两个过程精确协调。近年来大量研究已从细胞水平展示了OC和OB之间相偶联的奇妙关系,它们经细胞内外多途径精确信号调控,涉及正负反馈环和双向作用机制,从而维持骨稳态。外泌小体(exosomes)是由细胞内多泡体(multivesicular body,MVB)与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种直径约60-100nm的膜性囊泡,参与细胞间的信息交流及多种生理病理过程。它可由淋巴细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞等多种细胞所分泌。既往的研究已证明外泌小体在骨髓瘤、骨肉瘤、帕金森病、阿尔茨海默症、结直肠癌等疾病方面具有重要作用。目前国内外有关破骨细胞来源外泌小体的研究报道较少,对破骨细胞外泌小体的生物学特性及其在成骨分化方面功能机制的研究可为骨质疏松、骨硬化等多种代谢性骨骼疾病的防治提供新的思路及方向。目的:分离鉴定破骨细胞外泌小体(exosomes),观察破骨细胞外泌小体在成骨前体细胞(kusao细胞)成骨分化中的作用,明确破骨细胞外泌小体是否促进了kusao细胞的成骨分化,寻找破骨细胞外泌小体促进成骨分化的关键因子。方法:1、用RANKL诱导因子对Raw 264.7细胞进行破骨诱导,对诱导后的细胞进行TRAP染色鉴定;2、用超滤离心法从破骨细胞上清液中分离破骨细胞外泌小体(OC-exosomes);3、Western blot检测外泌小体(exosomes)特征蛋白CD9、CD63的表达并对其进行Nanosight粒度分析;4、观察PKH67标记的外泌小体靶定受体细胞kusao;5、将kusao细胞分成3组,完全培养基组(CM组),成骨诱导液组(OM组),成骨诱导液+破骨细胞外泌小体组(OME组),隔天换液,培养14天后通过Western blot、茜素红染色、Von kossa银染色、q-PCR检测等,明确破骨细胞外泌小体在kusao细胞成骨分化中的作用;6、运用蛋白组学分析方法分析破骨细胞外泌小体,寻找出关键蛋白并通过Western blot、q-PCR检测进一步验证。结果:1、TRAP染色可见红色多核、体积大、形状不规则的TRAP阳性巨细胞,即为破骨细胞;2、破骨细胞上清液中检测到大小均一、直径约为50-200nm的膜性微囊泡结构,经Western blot检测证实其表达外泌小体特征蛋白CD9、CD63,鉴定为破骨细胞外泌小体;3、PKH67标记的破骨细胞外泌小体能靶定受体kusao细胞;4、Western blot检测结果显示OM组RUNX2蛋白的表达量是CM组的1.25倍、OME组的2.72倍。5、茜素红染色结果显示CM组、OM组、OME组的钙盐沉积面积占总面积的比值分别为:0.21%、3.47%、20.74%;6、Von kossa银染色结果显示CM组、OM组、OME组的钙盐沉积面积占总面积的比值分别为:0.066%、2.64%、20.89%;7、q-PCR结果分析显示:(1)OME组RUNX2的表达量明显较OM、CM组少,且差异具有统计学意义(P<0.05);(2)OME组SPP1的表达量较OM、CM组少,且差异具有统计学意义(P<0.05);8、蛋白组学分析发现破骨细胞外泌小体中MMP9的表达量是Raw 264.7细胞外泌小体的13.552倍;9、Western blot检测结果显示MMP9蛋白的表达量在OC-exosome组明显高于RC-protein、OC-protein组(P<0.01);10、q-PCR检测结果显示:成骨诱导14天后,与成骨诱导液组(OM组)相比,成骨诱导液+破骨细胞外泌小体组(OME组)的MMP9基因表达明显上调,有统计学差异(P<0.01)。结论:1、应用超滤离心法成功从破骨细胞上清液中分离出外泌小体;2、破骨细胞外泌小体具有促进成骨前体细胞(kusao细胞)成骨分化的作用;3、破骨细胞外泌小体中高表达MMP9,可能是促进kusao细胞成骨分化的关键因子。