Acinetobacter sp.UN-16细胞不对称合成(R)-肾上腺素的研究

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(R)-肾上腺素作为儿茶酚胺和拟肾上腺素药物的典型代表,在临床及其它潜在的疾病治疗方面有着重要的作用。目前(R)-肾上腺素主要靠有机合成得到消旋体,再经过手性拆分这样的传统方法获得,能否找到一条绿色、有效的生物合成途径,对(R)-肾上腺素的制备具有重要意义,同时也为和它具有类似结构的儿茶酚胺和拟肾上腺素药物的绿色合成提供了参考。本课题组以闽江口湿地为筛选样本,高效液相色谱和高效毛细管电泳为检测手段,得到了一株能不对称还原肾上腺酮为(R)-肾上腺素的菌株G92,其产物得率为和对映体过量值分别为31.2%和大于99%;经16S rDNA序列和进化发育树分析发现G92属于不动杆菌属,命名为Acinetobacter sp. G92;对Acinetobacter sp. G92进行紫外、亚硝基胍以及紫外-亚硝基胍复合诱变发现,一株经复合诱变的Acinetobacter sp.UN-16对(R)-肾上腺素的收率达到了最高的54.9%。利用单因素法确定了Acinetobacter sp.UN-16细胞产(R)-肾上腺素的培养基碳、氮源及无机盐的类型;使用响应面优化法确定了发酵培养基组成比,优化的培养基为:甘油(9.12g/L)、牛肉膏(7.82 g/L)、NH4H2PO4(5.65 g/L)、K2HPO4(0.1 g/L)、 MgSO4(0.1 g/L)、MnSO4(0.01 g/L)、ZnSO4(0.01 g/L);在最优培养基条件下,继续优化了摇瓶发酵工艺条件,最优条件为:接种量1%(V/V),培养基pH7.4,发酵体积20mL,底物浓度8mM,底物加入时间18h,发酵结束时间22h,温度34℃,转速200r/min;在最优培养基及发酵工艺下,水相中(R)-肾上腺素收率为68.2%。为了突破水相中底物和产物的酶抑制性以及溶解性对Acinetobacter sp. UN-16细胞不对称还原反应的限制,本研究考察了14种不同亲水性离子液体介质中细胞不对称合成(R)-肾上腺素的情况,发现在含[HOOCEMIM]NO3介质中产物收率达到了75.4%,明显超过水相中的68.2%;紫外吸收值和流式细胞仪测定结果表明,各离子液体介质中的细胞膜通透性和完整性都发生了不同程度的改变,其中,[HOOCEMIM]NO3介质中细胞膜完整性最好;经过生物转化工艺优化,含[HOOCEMIM]NO3介质中发酵产物收率达到了最大的79.5%,底物添加量从8mM提高到12mM。
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