琼胶酶AgaB是本试验室从海洋假别单胞菌CY24中克隆得到的一个新颖的胞外琼胶酶。研究表明AgaB是一个结构和功能全新的β-琼胶酶，降解琼脂糖的主要产物为新琼八糖和十糖，最小底物为十二糖，作用机制为倒位型，在家族划分上该酶不属于任何一个已知的糖苷水解酶家族，这些都不同于已发现的其它琼胶酶。AgaB结构上的新颖性和功能上的特异性决定了它在工业和药用方面拥有潜在的应用价值。但是AgaB较低的温度稳定性(在高于35℃的情况下容易失去酶的活性)限制了它在工业上的更大规模的应用。实验室前期工作建立了耐热性明显提高的突变株M446，但其催化活性相比于野生型下降了20％。本论文旨在通过定向进化的方法，在保持M446耐热性的前提下提高其催化活性。 定向进化的两个关键步骤是建立分子的多样性文库和高通量筛选体系。本文采用易错PCR和化学诱变来建立分子的多样性，以组成型表达载体pBS-ks(sv)作为载体建立突变体文库。易错PCR引起的碱基突变多发生在胸腺嘧啶和腺嘌呤位点，而化学诱变剂甲基磺酸乙酯主要引起鸟嘌呤位点的突变，在一定程度上弥补了易错PCR的不足。根据琼胶酶水解琼胶引起琼胶液化在平板上产生透明水解圈，而且相对酶活较高的突变株在平板上形成较大的水解圈的特性建立了高通量筛选体系。突变菌株在37℃下过夜培养，筛选水解圈/菌落克隆直径大于野生型菌的克隆，作为研究对象进行发酵液上清和纯酶水平上的进一步鉴定。最终我们获得了一个热稳定性和产物性质没有改变而比活力为M446 3倍的突变株，命名为M117。测序结果表明，M117发生了四处碱基替代，其中两处引起了氨基酸替代，分别是Arg9→Lys，Ilell 1→Val，另两处为无义突变。其中第9位的氨基酸突变存在于信号肽区域，该区域在蛋白质跨膜转运的时候被切除，对成熟酶的比活力没有影响，由此，可以推断引起突变株M117比活力提高的主要原因是第111位氨基酸的突变。 为了推测突变株M117催化活性提高的机制，我们分别测定了M117与M446的动力学常数，结果表明，突变株M117的K<,m>值比M446降低了14倍，而其K<,cat>值变化不明显。由此可以推断，突变株M117催化活性提高的主要原因是酶与底物的结合能力增强。实验中发现的氨基酸替代为缬氨酸替代了异亮氨酸，二者均 为疏水性氨基酸，但是缬氨酸的侧链基团比异亮氨酸的小，推测第111位的氨基酸可能位于底物结合位点附近或者属于底物结合位点的一部分，而短的侧链基团对底物进入催化腔的空间位阻比较小，有利于底物与底物结合位点的结合。另一方面，因为异亮氨酸与缬氨酸的性质比较类似，所以这种替换没有造成突变株M117其它性质的改变。 综上所述，应用定向进化方法，我们得到了一个既保持了耐热性和产物特性，又提高了催化活性的突变株M117。其进一步提高的催化活性，将会使突变株M117在食品、化妆品和医药方面得到更大规模的应用。此外，由于序列和结构的新颖性，使得AgaB三维结构的确定非常困难，而突变株M117的获得对于确定AgaB的结构具有重要的指导意义。