本学位论文得到国家自然科学基金《天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性的相关性和炮制的影响》(No.81173549)、《天南星科有毒中药矾制解毒共性规律研究》(No.30973939)、《半夏刺激性毒性的物质基础及炮制解毒机理研究》(No.30772785)项目的连续资助。半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的块茎,有毒。误服半夏生品或鲜品可导致唇舌、咽喉肿胀,严重者甚至引起死亡。半夏的毒性主要表现为对粘膜的强烈刺激,半夏生品粉末腹腔注射可使小鼠腹腔毛细血管通透性增加,渗出液中炎症介质PGE2含量显著增加,显示半夏的刺激性毒性作用可能是一种接触性刺激后产生的强烈炎症反应。前期研究表明,半夏的毒性成分主要是具有特殊晶形的“毒针晶”。大量极细长、质地坚韧的毒针晶,可直接刺入粘膜,导致粘膜破损,大量的炎症介质释放,促使产生强烈的炎性肿胀和疼痛。毒针晶主要由草酸钙、蛋白组成,蛋白含量超过6%,被课题组称之为“毒针晶复合物”。研究发现半夏毒针晶中带有的毒蛋白主要是凝集素蛋白,研究发现半夏的凝集素蛋白可引起中性粒细胞迁移,具有显著的诱导炎症发生作用且此作用可能与居留巨噬细胞相关,被认为是半夏毒针晶中的化学刺激性毒性成分。因此深入研究半夏毒性成分毒针晶、凝集素蛋白的致炎效应,对揭示半夏刺激性毒性产生的作用机制具有重要的意义。历代本草记载生姜具有解半夏毒性的作用。葛洪《肘后备急方》：“中半夏毒以生姜汁干姜并解之”。吴仪洛《本草丛新》“半夏性畏生姜,用之以制其毒,功益彰”。现代临床常见的半夏、天南星中毒病例亦常采用大量生姜捣汁含服漱口,并用生姜擦口唇及四周皮肤缓解肿胀。课题组的前期研究也表明,单纯以生姜汁浸泡半夏或毒针晶,对于半夏的毒性物质毒针晶的本身没有破坏作用,但对于半夏已经产生的毒性具有降低或消除作用。文献研究发现,生姜及生姜的提取物具有显著的抗炎、镇痛作用。前期课题组的研究发现,生姜汁及生姜中的姜辣素类成分可以明显抑制半夏毒针晶导致的炎症反应,抑制炎症因子COX-2、PGE2、TNF-α、NO的合成与释放。故本学位论文提出中医传统的“生姜解半夏毒”理论可能与“生姜能够拮抗因半夏毒针晶、凝集素蛋白所致机体炎症毒性的机制相关”的假说。根据提出的假说,本学位论文从细胞分子水平,进一步研究半夏毒针晶、半夏凝集素蛋白的致炎作用机制。同时提取分离生姜中抗炎有效部位姜辣素,研究姜辣素类成分对半夏毒性成分半夏毒针晶、凝集素蛋白所致炎症反应的拮抗作用及作用机制,为揭示传统中医临床“生姜解半夏毒”的现代科学内涵提供科学依据。主要工作内容和研究结果包括以下几部分：1.半夏毒针晶及凝集素蛋白的致炎作用的体外实验研究建立巨噬细胞体外培养模型,研究半夏毒针晶、凝集素蛋白对巨噬细胞释放炎症因子的影响；采用扫描电子显微镜研究半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激巨噬细胞对巨噬细胞形态的影响；建立巨噬细胞-中性粒细胞共培养模型,采用体外中性粒细胞迁移实验研究半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激引起的中性粒细胞迁移与巨噬细胞的相关性。研究结果显示半夏毒针晶、凝集素蛋白均可诱导巨噬细胞释放大量炎症因子,扫描电镜显示巨噬细胞可吞噬半夏毒针晶；凝集素蛋白可致巨噬细胞明显肿大,最终导致细胞膜破损,细胞死亡。体外实验显示半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激巨噬细胞均可诱导显著的中性粒细胞迁移,并且半夏毒针晶、凝集素蛋白对巨噬细胞具有协同刺激作用。上述研究表明半夏毒针晶、凝集素蛋白的对机体产生严重的刺激性毒性作用是通过刺激后激活并诱导巨噬细胞释放大量炎症因子,导致中性粒细胞向炎症部位聚集,造成严重的炎症反应,且半夏凝集素蛋白可协同毒针晶加重炎症反应程度。研究进一步确证了半夏中带有凝集素蛋白的毒针晶复合物作为半夏的毒性成分确实能够导致炎症毒性。2.半夏凝集素蛋白的致炎机制研究采用Western Blot检测半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞后,细胞内静息NF-κB的激活水平与细胞内RIP3、Caspase8的表达水平；使用倒置荧光显微镜和荧光酶标仪定量检测半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞释放ROS的水平。实验结果显示,半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞后,细胞浆内NF-κB的二聚体P65水平显著下降,而细胞核内的P65水平显著升高,并且此作用呈量效相关；巨噬细胞内RIP3的表达水平显著升高,Caspase8的表达水平显著下降；半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞后,可以使巨噬细胞内ROS的水平显著上升,并呈量效相关。故半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致炎症的机制是促使细胞浆内静息NF-κB的二聚体P65转位至细胞核中,激活NF-κB信号通路,从而导致炎症的发生；抑制Caspase8相关的细胞凋亡且同时激活RIP3相关的氧化应激反应,促使巨噬细胞释放大量ROS导致程序性坏死,加重炎症反应程度。3姜辣素对半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激性毒性的抗炎机制研究生姜挥发油部位采用水蒸气蒸馏的方法提取；生姜乙酸乙酯提取后去挥发油得到姜辣素部位；药渣经水提取得到药渣水提物部位。采用紫外分光光度法对姜辣素部位中总姜辣素含量进行测定；采用巨噬细胞体外培养模型,以炎症因子TNF-α为指标,筛选生姜中拮抗半夏刺激性毒性的有效部位。实验结果显示,生姜姜辣素部位中总姜辣素含量为85.21%；分离获得的姜辣素、挥发油和药渣水提物三个部位中只有姜辣素部位可显著降低半夏毒针晶导致的巨噬细胞TNF-α释放增加,具有拮抗半夏致炎效应的作用。此结果也表明获得的总姜辣素部位可以用于生姜拮抗半夏刺激性毒性的作用机制研究。在姜辣素拮抗半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激性炎症作用机制研究中,本论文采用巨噬细胞体外培养模型,研究姜辣素对半夏毒针晶、凝集素蛋白释放炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的影响；采用扫描电镜和显微镜研究姜辣素对半夏毒针晶、凝集素蛋白致巨噬细胞形态变化的影响；采用巨噬细胞-中性粒细胞体外共培养模型,研究姜辣素抑制半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激巨噬细胞对中性粒细胞迁移的影响;采用倒置荧光显微镜研究姜辣素对半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞释放ROS水平的影响；采用Western Blot检测姜辣素拮抗半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞后,细胞内静息NF-κB的激活水平与细胞内RIP3、Caspase8的表达水平。上述实验结果显示,姜辣素可以显著拮抗半夏毒针晶、凝集素蛋白诱导巨噬细胞释放炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的作用,并呈量效相关；姜辣素可抑制半夏毒针晶导致的细胞变形及吞噬异物的作用；抑制半夏凝集素蛋白导致的细胞肿胀和细胞膜破损作用,表明姜辣素可显著拮抗半夏毒针晶、凝集素蛋白激活巨噬细胞；姜辣素可显著抑制半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激巨噬细胞所导致的中性粒细胞迁移及ROS的释放；抑制半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致的NF-κB的激活,同时可恢复Caspase8的表达水平,降低RIP3的表达水平。故姜辣素拮抗半夏刺激性毒性的作用表现为抑制了半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致的炎症反应,抑制了包括巨噬细胞激活,炎症因子释放,中性粒细胞迁移聚集,抑制了NF-κB炎症通路和RIP3相关的程序性坏死通路的激活。通过上述研究,进一步证实了半夏的刺激性毒性作用是半夏毒针晶产生的机械刺激与半夏凝集素蛋白产生的化学刺激双重作用的结果。半夏中的毒性成分毒针晶可刺激性巨噬细胞发生吞噬作用,同时毒针晶及凝集素蛋白均可诱导巨噬细胞释放大量炎症因子,并诱导中性粒细胞到达炎症部位,造成严重的炎症反应,且毒针晶与凝集素蛋白可协同作用加重炎症反应程度。半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致炎症的机制是促使细胞浆内静息NF-κB的二聚体P65转位至细胞核中,激活NF-kB信号通路,从而导致炎症的发生；抑制Caspase8相关的细胞凋亡并激活RIP3相关的氧化应激反应通路,促使巨噬细胞释放大量ROS导致程序性坏死,加重炎症反应程度。生姜中拮抗半夏刺激性毒性的有效部位是姜辣素部位。姜辣素拮抗半夏刺激性毒性的机制是抑制了半夏毒针晶、凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致的炎症反应,抑制了包括巨噬细胞激活,炎症因子释放,诱导中性粒细胞迁移聚集；抑制RIP3相关的氧化应激反应,抑制因巨噬细胞释放ROS导致的程序性坏死,进一步减轻凝集素蛋白引起的炎症反应。本学位论文是对“生姜解半夏毒”的传统中医理论在细胞及分子水平上作了深入研究,研究结果对揭示半夏刺激性毒性的致炎机制,阐释生姜解毒作用机制具有重要的科学价值。同时,本学位论文的研究结果将为天南星科有毒中药炮制和临床安全使用提供理论依据,为传统中医理论现代化研究提供借鉴。