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手足口病是由多种人肠道病毒感染引起的儿童常见传染病,在世界范围内尤其是亚洲地区流行并报道,五岁以下婴幼儿是手足口病的主要易感人群。我国自2008年安徽省阜阳市发生EV71感染引起的手足口病疫情爆发以来,其每年的发病病例数已经连续10年超过百万,高居法定报告丙类传染病的首位。肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是引起重症手足口病的主要病原体,其感染可入侵中枢神经系统,导致严重的神经系统疾病,包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹和神经源性肺水肿等。但由于其致病机制不清,严重阻碍了临床治疗和抗病毒药物的研发,目前尚无特异的抗病毒药物,成为我国公共卫生亟待解决的问题之一,因此研究EV7感染和致病的作用机制,对手足口病的预防和治疗具有重要的指导意义。病毒需要在宿主细胞内才能够进行增殖,其与宿主细胞的相互作用,决定了病毒感染的结局。细胞死亡的多种方式就跟病毒感染有复杂的相互作用,研究表明细胞凋亡、细胞焦亡和细胞自噬在多种病毒的感染复制中发挥重要的作用。近年来报道表明流感病毒、寨卡病毒和肠道病毒感染均能够诱导细胞发生焦亡。细胞受到外源微生物等多种刺激下,细胞内的模式识别受体NOD样受体识别信号,形成炎性小体,活化caspase-l,活化的caspase-l切割Gasdermin D(GSDMD),其切割产生的N端l-275aa片段可以定位于细胞膜,诱导细胞的焦亡。Gasdermin家族的另一成员GSDME也可以介导细胞焦亡,是将化疗药物诱导的细胞凋亡转换为细胞焦亡,在化疗药物诱导的正常组织损伤中起重要作用。实验室前期报道表明EV71感染可以激活NLRP3炎性小体,引起IL-1β和IL-18的分泌,并且病毒编码的3C和2A反过来可以引起NLRP3的切割进而抑制NLRP3炎性小体的激活。同时3C蛋白酶也可以切割GSDMD,破坏其诱导细胞焦亡的N端1-275片段。但是我们发现EV71感染细胞仍可以诱导多种细胞发生细胞焦亡,本课题在此基础上进一步研究EV71引起细胞焦亡的机制,以及焦亡在EV71感染复制和致病中的作用。我们用EV71感染HeLa、RD和SK-N-SH细胞,通过LDH释放、ATP活性检测和显微镜下观察细胞形态,发现EV71能够诱导这些细胞发生焦亡。同时WB结果检测表明,EV71感染可以诱导内源GSDME的切割。为了进一步验证EV71介导的GSDME的切割机制,我们构建了两端分别带Myc和Flag标签的GSDME表达质粒,在293T外源转染实验中发现,EV71感染可以诱导过表达GSDME的切割,而EV71 3C和2A蛋白酶的过表达并不能引起GSDME的切割。文献报道表明GSDME能够被caspase-3切割,其切割位点为D270,我们体外构建GSDME D270E位点突变体,并过表达于293T细胞,发现EV71感染后不能引起GSDMED270E突变体的切割,提示EV71感染可能在D270位点引发GSDME的切割。进一步检测发现,EV71感染引起内源caspase-3的活化,且caspase-3敲除后,EV71感染不能诱发GSDME的切割,表明EV71感染通过caspase-3的活化引发GSDME在D270位点的切割。为了进一步验证caspase-3和GSDME在EV71诱导的细胞焦亡中的作用,我们构建了cas Gse-3,Gsdme基因单敲以及二者双敲除的细胞系。结果发现,同野生型细胞相比,cospase-3和Gsdme基因单敲以及caspase-3/Gsdme双敲的细胞中,病毒感染引起细胞焦亡的比例明显降低,进一步证明EV71感染通过激活caspase-3,引起GSDME的切割,进而引发细胞焦亡。GSDME介导的细胞焦亡在病毒感染中的作用和致病机制还未见报道。我们用EV71感染野生型和Gsdme基因敲除的小鼠,发现Gsdme基因敲除小鼠生存率高于野生型小鼠,提示GSDME在EV71感染致病中起重要作用。进一步检测发现Gsdme敲除小鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1的释放减少。提取野生型和Gsdme敲除小鼠的骨髓巨噬细胞,EV71感染,发现Gsdme敲除细胞中炎性因子的释放减少,细胞焦亡比例降低。另外,本课题组前期发现高尔基体蛋白ACBD3参与肠道病毒复制,那么ACBD3复合物中其他蛋白是否参与病毒复制,我们对其复合物中的一个成员PEF1进行了分析,发现PEF1也影响EV71的复制。PEF1属于penta-EF-hand蛋白家族,是一种重要的宿主因子,参与多种细胞生命活动,例如内质网和高尔基体之间的膜泡运输、蛋白泛素化、蛋白水解等。我们的结果表明,PEF1敲低或敲除的细胞中,EV71的复制显著降低;EV71感染不影响PEF1的表达,但能影响PEF1在细胞内的分布,减少其与ACBD3的共定位,其具体机制还需要进一步的研究。综上所述,EV71感染可以激活caspase-3,进而引起GSDME的切割,诱导细胞焦亡,同时小鼠中Gsdme的敲除减轻了 EV71诱导的疾病,提示GSDME在EV71感染致病中发挥重要的作用,为进一步阐明EV71的致病机制提供新的理论依据。另外,我们发现PEF1也是参与EV71复制的重要宿主因子。