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周围神经损伤后,轴突被切断的脊髓运动神经元经历一系列逆向退行性改变并可能导致神经元凋亡。有报道轴突切断和靶点缺失可诱发神经元凋亡。多种因素可能始发神经元的凋亡通过数种凋亡通路.
外源性凋亡通路是由fas配基(FasL)与caspase-8的细胞表面受体结合触发,接着激活caspase-3,后者引起细胞内凋亡特征性改变。与之相反,内源性通路,由细胞毒性应激触发,引起凋亡前体Bcl-2家族成员,如Bax,异位到线粒体后引发线粒体细胞色素C进入胞浆,在胞浆内促进caspase-3的激活。Caspase-3是一个细胞凋亡的关键性执行蛋白。
本研究应用脱细胞神经支架修复大鼠1cm坐骨神经缺损模型,观察脊髓内细胞凋亡标记物FasL和Caspase3的表达,评价脱细胞神经支架对神经运动神经元的保护作用。
方法：
1、化学萃取脱细胞方法制备脱细胞支架；
选用Wistar大鼠10只,经过麻醉后取出双侧坐骨神经,采用化学萃取方法制备脱细胞神经基质支架。制备的脱细胞大鼠坐骨神经放入内含100ug/ml庆大霉素和100ug/ml链霉素的PBS(PH7.4)液中,4℃下保存备用。
2、实验动物和分组；
成年健康Wistar大鼠30只,体重200～250g,由中国医科大学实验动物部提供。随机分为三组,每组10只,1.(N)正常组,2.对照组(坐骨神经缺损组,SNT),3实验组(脱细胞神经支架桥接坐骨神经缺损组,ANA).
3、取材和检测；
动物饲养1个月后,取各组相应节段脊髓(L4-L6节段),进行免疫组织化学染色和Western Blot检测FasL、caspase3在脊髓内的表达。
实验结果：
1、FasL的免疫组织化学染色结果显示:FasL阳性反应物定位于细胞质,呈棕黄色。正常组偶见阳性明显染色。对照组阳性细胞数目明显多于实验组,细胞质呈棕黄色,细胞核无阳性染色。实验组可见阳性细胞,为细胞质着色,细胞核无阳性染色。
2、Caspase-3的免疫组织化学染色结果显示:Caspase-3阳性反应物定位于细胞质,呈棕黄色,均匀弥漫染色。正常组偶见明显阳性染色。对照组可见阳性细胞,略多于实验组,为细胞质着色,细胞核无阳性染色。实验组则也可见阳性细胞,细胞质呈棕黄色。
3、FasL的Western Blot结果显示:对照组FasL较正常组表达明显增多(*P＜0.05);而实验组FasL较正常组表达没明显。实验组较对照组明显下降(＃P＜0.05)。
4、caspase3的Western Blot结果显示:对照组caspase3较正常组表达明显增多(*P＜0.05);而实验组caspase3较正常组表达没明显高,实验组较对照组明显下降(＃P＜0.05)。
结论：
1、FasL和Caspase-3在脊髓运动神经元的表达,提示这些因子与脊髓神经元的凋亡信号传递功能有关。
2、Fasl和Caspase-3在对照组的表达高于实验组,表明脱细胞神经支架对脊髓前角运动神经元有保护作用。