姬松茸碱提水溶性多糖提取、结构鉴定及抗氧化活性研究

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姬松茸(Agaricus Blazei Murill,ABM)又名巴西蘑菇,原产于巴西,是一种药食兼用的珍稀食用菌,因具有重要的药用价值,在我国和日本广泛种植。姬松茸富含多糖、蛋白、核酸、脂肪、皂甙、单宁、甾醇、矿物质、微量元素及人体必需的氨基酸等。由于含有甾醇、多糖等活性成分,姬松茸在抗肿瘤、降低血糖、抗疲劳、抗氧化等方面具有显著效果。本文采用碱液提取热水浸提后的姬松茸子实体粉末残渣,优化了提取工艺,并初步制备碱提水溶性姬松茸粗多糖ABMP,研究了多糖的抗氧化活性,后经离子交换柱和凝胶柱层析分离纯化后得到均一多糖ABMP-2-a,并对其初级结构进行了鉴定,探讨了均一多糖的溶液构象和形态学特征。对姬松茸子实体粉末以1:20(w/v)料液比加入蒸馏水,100℃煮沸2 h。得到的残渣经碱液提取后,过滤得到上清液,经3 mol/L乙酸中和后离心分离。收集上清液经透析,乙醇醇沉,离心过滤,蒸馏水复溶后冻干,得到碱提水溶性粗多糖ABMP。响应面优化得到的最佳提取工艺条件为:碱液浓度5.33%,温度60℃,时间2.23 h,多糖的得率为12.69±0.08%(理论值为12.74%)。但是温度过高可能会使多糖结构遭到破坏,因此结合实际情况,选择提取工艺为碱液浓度5%,温度50℃,时间2 h提取多糖进行后续结构鉴定,此时多糖得率为12.44±0.12%,多糖含量为37.80±0.20%,蛋白质含量为32.12±0.18%。体外抗氧化活性研究表明,ABMP对DPPH、ABTS自由基清除能力和还原力的IC50值分别为0.104、0.237和0.0136 mg/mL,表现出ABMP多糖具有较好的抗氧化活性。ABMP粗多糖经DEAE Sepharose Fast Flow离子柱层析,0.2 mol/L NaCl溶液洗脱,洗脱液经透析袋(MWCO:20000 D)脱盐后,冻干得到ABMP-2组分。ABMP-2用蒸馏水溶解,过Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析分离纯化得到均一多糖ABMP-2-a。用激光光散射仪与示差折光检测联用仪测得多糖绝对分子量为1.87×105 Da。经红外光谱和紫外全扫描,表明ABMP-2-a不含核酸和蛋白质,并且符合多糖特征,为α构型中性多糖。用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对ABMP-2-a进行乙酰化和甲基化分析,结果表明ABMP-2-a主要由L-Ara、D-Xyl、D-Man、D-Glc和D-Gal组成,摩尔比为0.53:0.37:1.00:13.65:6.77,并且ABMP-2-a的主链主要由6-连接的中性α-吡喃型葡聚糖(α-6-linked Glcp)构成。对碱提水溶性均一多糖ABMP-2-a的溶液构象和形态学特征进行研究。刚果红实验结合圆二色光谱结果表明,ABMP-2-a没有三螺旋结构;扫描电镜结果表明,ABMP-2-a主要以长条状存在,长条状交叉连接,形成复杂、稳定的网络结构。长条状表面光滑,没有孔结构,表明分子间作用力强,也说明了结构稳定;热特性分析表明,多糖结构在30-300℃范围内,ABMP-2-a热稳定性较好,结构较稳定,这和扫描电镜结果一致;X射线衍射实验表明,ABMP-2-a为半结晶和无定形形态。原子力显微镜结果表明ABMP-2-a在溶液中为柔顺链构象结构,不存在三螺旋结构,和刚果红实验结果一致。
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