Leber’s hereditary optic neuropathy(LHON)是一种母系遗传性视神经疾病，患者常为青少年，且伴有不同程度的视力损伤，主要病理改变为视网膜神经节细胞的缺失。LHON的发病与线粒体功能障碍有关，大多数LHON患者线粒体基因组存在点突变，使得线粒体呼吸链复合体功能受损从而导致线粒体功能障碍。其中三个原发线粒体突变，MT-ND13460G>A、MT-ND411778T＞C和MT-ND614484T＞C，约占据了LHON患者线粒体突变的90％，此外，其他修饰因子（核基因、线粒体继发突变和线粒体单体型）也影响了LHON的外显率和表现度。
　　目的：
　　对携带线粒体ND6基因14502T＞C继发突变位点的LHON家系进行详细的临床和分子遗传学分析，对家系先证者建立转线粒体细胞系，分析线粒体14502T>C突变对携带线粒体14484T＞C原发突变的Leber遗传性视神经病变发病影响，为LHON发病机制的研究、LHON的筛查、诊断和治疗提供了新的依据。
　　方法：
　　1.对收集的1536例LHON患者和472例与LHON患者无血缘关系的正常对照者的三个LHON主要原发突变位点（MT-ND13460G>A、MT-ND411778T＞C和MT-ND614484T＞C）进行了基因扩增和测序，并与修正的剑桥标准序列（NC_012920）进行比对。
　　2.对仅携带m.14502T＞C突变的家系、仅携带m.14484T＞C突变的家系、同时携带m.14502T＞C和m.14484T＞C双突变的家系进行详细的临床和分子遗传学分析。
　　3.将仅携带m.14502T＞C突变的家系、仅携带m.14484T＞C突变的家系、同时携带m.14502T＞C和m.14484T＞C双突变的家系先证者及正常对照者的外周血构建永生化淋巴细胞系和转线粒体细胞系，从细胞水平检测线粒体突变对LHON发病的影响，主要包括氧耗量，ATP产量、线粒体活性氧（ROS）的产生、细胞膜电位的改变、细胞凋亡及自噬水平的改变。同时对线粒体相关蛋白表达水平和线粒体复合体Ⅰ表达水平进行了检测。
　　4.对实验结果进行统计学分析，分析m.14502T＞C突变是否影响携带m.14484T＞C原发突变的细胞的线粒体呼吸功能。以p值小于0.05差异有统计学意义或p值小于0.01差异具有显著性统计学意义。
　　结果：
　　1.在1536例LHON患者ND6基因上共存在92个变异位点，占ND6基因突变比例的17.56％。其中有53例携带m.14484T＞C突变，40例携带m.14502T＞C突变，6例同时含有m.14502T＞C和m.14484T＞C突变。这些患者一共94例占收集到的LHON患者总人数的6.1％，m.14484T＞C突变占3.4%，m.14502T＞C突变占2.1%，m.14484T＞C突变和m.14502T＞C突变占0.03%。
　　2.我们对仅携带m.14502T＞C(WZ425)突变家系，仅携带m.14484T＞C(WZ18)突变家系，同时携带m.14502T＞C和m.14484T＞C(WZ67)的双突变家系和不含两种突变的正常对照者进行了转线粒体细胞系的构建并进行线粒体呼吸功能性实验。仅携带m.14502T＞C突变的先证者，仅携带m.14484T＞C突变的先证者、与携带m.14502T＞C和m.14484T＞C双突变的先证者其基础OCR（basal OCR），分别是对照组的86.6％、75.4％和61.1％；ATP和ROS产量分别是对照组的77％、68％、52％和110％、136％、183％，均具有统计学意义。携带双突变家系先证者其ND6蛋白表达量和复合体Ⅰ表达水平也明显下降。
　　3.在对细胞凋亡水平的检测中发现凋亡通路上的相关蛋白在三组突变细胞中表达量均有不同程度的升高，其中携带双突变家系先证者相关蛋白升高明显提示有细胞凋亡的发生。在自噬中双突变家系先证者自噬通路上的关键蛋白LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+Ⅱ)的比值也有升高，提示双突变组中有自噬的发生。
　　结论：
　　本研究通过对构建的LHON家系转线粒体细胞系进行生化实验，发现同时携带m.14502T＞C和m.14484T＞C双突变的先证者细胞株比仅携带m.14502T＞C突变和仅携带m.14484T＞C的先证者细胞株线粒体功能障碍更加严重，表现为ND6蛋白和线粒体复合体Ⅰ表达水平在双突变组中严重下降，ROS过量表达和ATP的显著减少。此外，携带双突变的细胞系其线粒体自噬水平和凋亡水平较正常对照组、携带单突变细胞组都有明显增高。因此，我们推测，ND6m.14502T＞C继发突变加剧了由m.14484T＞C原发突变导致的细胞呼吸链损伤，最终导致LHON的高外显率和高表达率。