乳腺癌是一种高发的恶性肿瘤,在大多数国家其发病率依旧逐年增加。根据美国癌症协会数据显示,仅在2017年新增乳腺癌患者超过25.5万,并且超过4万患者因此死亡。在我国,乳腺癌发病率和死亡率亦呈逐年递增的趋势。根据国家癌症中心最新统计数据,超过27.8万的中国大陆地区女性被诊断出乳腺癌,死亡人数6.4万。目前,由于早期检测手段的提高和治疗技术上的发展,乳腺癌患者的存活率大大提高。然而,转移性乳腺癌疾病的患者5年内生存率依旧较低。造成乳腺癌侵袭转移的主要原因在于乳腺癌遗传异质性改变,例如癌基因的异常扩增以及不断演变的基因突变,都可以导致乳腺癌临床诊疗效果上的差异。随着基因组技术不断发展成熟,已经发现多个致癌基因与乳腺癌发生发展密切相关。但是共激活的组合癌基因所导致乳腺癌的恶性发展,其具体信号机制始终没有确切研究答案。因此,挖掘更多新型的与乳腺癌相关的癌基因,深入研究乳腺癌的发生发展尤其是共激活癌基因条件下信号调节机制,发现更多与乳腺癌进展相关的关键基因,通过抑制这些致癌基因,逆转信号通路活化,克服肿瘤转移耐药,是目前乳腺癌科研及临床研究中的重要任务。本篇论文将分为两部分对乳腺癌相关癌基因的作用机制以及所诱导的信号通路进行深入研究。通过生物信息学分析,首次探讨PIK3CA突变和HER2过表达同时存在的乳腺癌,出现显著变化的信号通路及其相关的调控基因,为乳腺癌发生机制以及诊疗思路提供崭新的探索方向;同时,我们发现一个新型癌基因——表皮生长因子样结构域9型（EGF-like domain,multiple 9,EGFL9）,通过结合并调控c-MET影响乳腺癌转移和干性功能。第一部分PIK3CA和HER2共激活的信号通路分析研究目的:HER2是诱导乳腺癌发生发展的主要受体之一。在乳腺癌患者中约有20%能够检测到HER2基因的扩增,40%此类型患者同时具有磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的突变。PI3K是一种细胞膜内的脂质激酶。当RTK受体受到胞膜外生长因子等的刺激活化后,能够募集PI3K启动其所参与的信号传导。PI3K突变是诱发癌症的主要原因。PIK3CA基因编码PI3K的p110α催化亚基,它的突变如H1047R位点,能够导致包括乳腺癌在内的多种癌症产生。临床上,HER2扩增同时具有PIK3CA突变,以及其导致的PI3K/AKT信号途径激活,被视作乳腺癌耐药的主要决定因素。为了探讨PIK3CA突变和HER2扩增共激活时与单一存在两个基因异常变化情况下的致癌作用和信号调节机制的不同,通过实验,本文具体探索了 PIK3CA突变与HER2扩增之间的关系,验证了异常基因共同存在下的致癌作用,同时通过微芯片分析发现了同时含有HER2和PIK3CA的乳腺癌细胞中相关基因和通路的变化。研究方法:在本研究中,利用生物信息学分析方法检测了 PIK3CA突变的乳腺癌中其他基因的扩增情况。体外实验中,在乳腺正常细胞系MCF10A内重新构建PIK3CA突变、HER2扩增以及同时具有两种基因异常的细胞模型。分别使用含有不同营养成分的培养基对乳腺癌细胞模型对比观察生长情况,了解不同营养成分对癌细胞生长的影响。在迁移侵袭实验中,使用Transwell小室观察不同基因变化的MCF10A细胞的穿膜情况。通过使用PI3K和HER2的抑制剂处理细胞,观察癌细胞的生长抑制情况,以及两种癌基因抑制剂之间的协同作用。使用Affymetrix微芯片对不同基因型的MCF10A细胞的基因调控进行对比分析,试图找出在三种基因型变化皆存在的情况下,细胞信号调节通路上的共同变化,以及共同激活异常HER2和PIK3CA基因时,与另外两种单独基因存在的癌细胞在信号调节通路上的差异和相关基因的变化情况。研究结果:（1）使用比较基因组杂交（aCGH）生物信息学技术检测到PIK3CA突变细胞中,在不同染色体上有多处基因扩增位点,其中以HER2扩增位点最为显著。（2）生长曲线测定、迁移侵袭实验发现,在同时含有两个基因变化的乳腺癌细胞中,其生长情况以及转移能力相较于单个基因作用更明显,在含有不同营养成分的培养基中不受影响。说明共激活突变型PIK3A和HER2扩增的细胞不受生长因子以及胰岛素的影响。药物抑制实验表明,协同使用药物的情形下具有更强抑制细胞生长增殖的能力。因此,抗HER2药物联合PI3K药物应是抗乳腺癌生长转移的重要靶点之一。（3）Affymetrix微芯片分析检测到多个基因的调节变化。通过对这些基因进行生物统计分析,结果表明在同时含有两种基因变化的乳腺癌细胞中,大部分明显受到调控变化的基因主要富集在4条信号调节通路上,分别是芳香族化合物受体（AhR）通路,AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路,蛋白泛素化通路,以及遗传性乳腺癌信号通路。重要的是,在同时含有PIK3CA突变和HER2扩增而非单一基因变化的细胞系中,多数受调控基因富集在细胞周期检控点调控通路和DNA损伤应答信号通路中。首次发现了共同激活致癌基因PIK3CA和HER2不仅能够导致乳腺癌进展,而且在信号调控上能够引发肿瘤DNA复制压力。这些发现为将来乳腺癌诊断以及治疗提供了新的思路。第二部分新型癌基因EGFL9调控乳腺癌转移及干性的研究研究目的:c-MET和EGFR作为RTKs受体家族成员被广泛研究。单一使用两种药物抑制剂对于部分乳腺癌亚型依旧有效。然而,不断出现的肿瘤转移及长时间使用药物后出现的更加复杂的耐药现象,不仅困扰着临床工作者阻止癌症进展,而且不断打击着乳腺癌患者的求生信心。近年,除单一受体作用外,越来越多的研究发现c-MET和EGFR在肿瘤发生发展中具有交互联络作用。这种作用可以受到细胞外液游离配体如HGF所支配,也可以受到受体本身所在细胞内部自分泌和旁分泌作用调节,诱导乳腺癌转移和耐药的生成。在临床应用过程中研究人员发现,对EGFR-TKI耐药的乳腺癌加用MET-TKI治疗能够有效增加乳腺癌对药物的敏感性。本部分研究通过实验为更完整的RTKs受体调控机制以及更有成效的进行靶向治疗提供思路。研究方法:本文通过实时定量PCR在14种乳腺癌细胞系中对整个表皮生长因子样（EGFL）家族成员基因分析,并使用免疫蛋白印迹技术加以验证,明确EGFL9在相应乳腺癌类型中的表达情况。通过体外的MTT和Transwell小室实验和体内裸鼠成瘤,观察肿瘤的生长和转移情况。使用核磁共振（MRI）成像技术和组织染色技术观察肿瘤远处转移,了解转移与EGFL9之间的相互关系。使用RTK磷酸化抗体阵列、激光共聚焦实验等观察在过表达EGFL9的乳腺癌细胞内信号调控机制。最后通过一系列癌干细胞特性实验,分析EGFL9与多潜能干性之间的关系,明确乳腺癌转移与干性之间的相互联系。研究结果:（1）通过PCR检测整个表皮生长因子样结构域（EGFL）家族在不同乳腺癌亚型中的表达情况。首次发现EGFL9是一种新型致癌基因,其主要在基底样乳腺细胞癌中高表达。（2）体内实验包括组织微阵列芯片分析,MRI以及体外实验（生长曲线,迁移侵袭）发现EGFL9过表达对乳腺癌细胞生长情况影响甚微,但能够导致乳腺癌细胞体外转移及体内向周围组织和/或远处肺部转移增加。（3）RTK磷酸化抗体阵列分析显示,EGFL9过表达能够同时激活c-MET和EGFR磷酸化。免疫蛋白印迹实验不仅验证EGFL9过表达以及敲除的乳腺细胞系中,该基因对两受体起到正向调控作用,而且还验证了其对于FAK、ERK1/2等下游因子的调控作用。（4）激光共聚焦实验结果表明,EGFL9调控c-MET和EGFR共同磷酸化作用是通过结合c-MET受体而实现的,而EGFL9和EGFR之间并没有这种直接相互作用的关系。药物抑制c-MET能够阻止EGFL9调控下的信号通路激活,并且可以逆转乳腺癌细胞的转移。（5）通过实时定量PCR技术对44个癌细胞干性标记物做表达分析,发现EGFL9能够导致与多潜能干性因子相关的Nanog、Oct-4、c-KIT的表达明显升高。这一结果亦通过免疫印迹实验得到验证。同时观察了细胞的成球情况以及与癌干性有关的ALDH+和CD44+/CD24-荧光标记的变化,发现EGFL9过表达时确实能够导致乳腺癌细胞形成更大更致密的干细胞球,ALDH+细胞增多,CD44+/CD24-细胞量基本保持不变。总结及创新性发现:我们探讨了在乳腺癌发生发展过程中起重要作用的两个基因共同作用下独特的信号通路调控关系;发现一个新型致癌基因,并且对这个基因诱导下的信号通路深入探讨。主要在以下几个方面有创新性的发现:（1）在同时含有PIK3CA突变与HER2扩增的乳腺癌细胞中,能够密切调控十条主要的信号调控通路及相关基因。在这十条通路中多数与细胞周期检控点以及DNA损伤修复有关。（2）在单独以及同时含有PIK3CA突变和HER2扩增的乳腺癌细胞中,AhR通路、AMPK通路、蛋白泛素化通路和遗传性乳腺癌相关信号调控是四条最为突出的受到共同调节的通路,可以用于指导相关乳腺癌亚型的靶向治疗。（3）发现EGFL9在基底样乳腺癌中高表达,是一种新型致癌基因。（4）EGFL9能够导致乳腺癌向周围组织以及远处转移,其过表达与乳腺癌转移密切相关。而EGFL9的敲除逆转了这些通路的活化,有效抑制癌细胞迁移和侵袭。（5）EGFL9诱发乳腺癌转移是通过直接结合c-MET受体,引发磷酸化的c-MET和EGFR共激活。药物抑制c-MET能够逆转EGFL9导致的信号通路的激活及细胞运动,从而逆转肿瘤形成。（6）EGFL9可以导致与癌干性相关的分子标记物及成球能力增强,为乳腺癌转移和干性特征之间联系提供理论依据。