角蛋白酶(keratinase)是一种能特异降解角蛋白的蛋白酶。近年来随着角蛋白酶在去垢剂的制造、皮革加工、食品工业和饲料生产中广泛的应用而日益受到人们的青睐。本文以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处采集的土壤为样品,筛选出一株可以利用羽毛并能高效降解羽毛粉的枯草芽孢杆菌,并克隆了其kerC基因和实现了该基因在大肠杆菌中融合表达。1.从四川农业大学养鸡场长期堆砌废弃羽毛处采集的土壤中筛选出了具有降解角蛋白能力的7株细菌。对其中产角蛋白酶酶活的最高的B-3菌株进行了形态观察、生理生化特性以及系统发育树分析,鉴定B-3为枯草芽孢杆菌,该菌发酵产角蛋白酶酶活力可达2.261U/mL。2.利用PCR技术克隆了编码枯草芽孢杆菌B-3的角蛋白酶基因。该基因序列全长1146bp,编码381个氨基酸,含信号肽序列。与GenBank数据库比对分析发现该基因与数据库中来自枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.:EU362730)相似性达到100%。蛋白结构域分析显示,kerC含两个丝氨酸蛋白酶家族的保守结构域,属于丝氨酸蛋白酶家族成员。3.以克隆的枯草芽孢杆菌B-3角蛋白酶基因为基础,利用大肠杆菌表达载体pET-32a(+)构建kerC原核表达载体pET-kerC,并转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。结果表明,该酶在大肠杆菌中获得了高效表达,在重组菌细胞裂解上清液中检测到角蛋白酶活性,酶活力可达14.814U/mL,比活力可达0.0852 IU/mg。SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量为60kDa左右(融合了硫氧还蛋白,Trx)。对重组角蛋白酶酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为65℃,最适pH值为7.0,热稳定性较差,耐碱(pH5.5-10.0处理后残余酶活力可保持最高酶活的80%以上)。