【摘 要】
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石斛兰(Dendrobium)是国际花卉市场上最受欢迎的兰花切花和盆花品种之一,但其易受细菌性软腐病侵染,令生产者蒙受巨大损失。苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)的aiiA基
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石斛兰(Dendrobium)是国际花卉市场上最受欢迎的兰花切花和盆花品种之一,但其易受细菌性软腐病侵染,令生产者蒙受巨大损失。苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)的aiiA基因编码的AiiA蛋白能降解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs),可以明显抑制马铃薯软腐病的发生。使用转基因技术导入外源抗病基因是目前兰花抗病育种的新方向,但目前的兰花遗传转化系统还不成熟。本论文以石斛兰大熊猫1号(D.Ekapol‘PANDA No.1’)为材料,应用农杆菌介导的方法将Bt的aiiA基因转入石斛兰,并对转化条件进行了优化,以研究研的AiiA蛋白对防治石斛兰软腐病的影响,并提高石斛兰的转化效率。
本研究通过PCR方法从Bt中克隆了aiiA基因,在双元转化载体pCAMBIA1301(含有潮霉素选择标记基因)基础上构建了分别受花椰菜花叶病毒35S(CauliflowerMosaic’Virus 35S promoter,CaMV 35S)启动子和玉米泛素启动子(maize ubiquitinpromoter)控制的表达载体pSAN和pUAN,以期比较这两种启动子在转基因石斛兰中的表达效果。
将pSAN和pUAN分别导入农杆菌LBA4404或EHA105,获得了4种工程菌,并比较了它们转化石斛兰的效率。GUS瞬时表达结果表明,带有pSAN或pUAN的EHA105均能比带有pSAN或pUAN的LBA4404更有效地转化石斛兰。
使用含有pSAN和pUAN的EHA105转化石斛兰,经过了4个月的选择培养,已获得一批潮霉素抗性的石斛苗。对部分抗性苗的叶片进行了GUS染色,结果表明该基因已稳定表达。用含有pUAN的EHA105转化石斛兰,研究了不同菌液浓度(OD<,600>)、侵染液添加或不添加乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)对转化效率的影响。GUS瞬时表达结果表明,只有当农杆菌生长至OD<,600>值为0.8时,添加AS能略为提高转化效率,而在OD<,600>值分别为0.6、1.0和1.2时,添加AS均会不同程度降低转化效率。在各种处理中,OD<,600>为1.0时不添加AS的转化效率最高,达44.4﹪。
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