人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是由胎盘滋养层细胞合成和分泌的一种糖蛋白激素，在早期妊娠中起促进胚泡发育、维持妊娠的作用。由于hCG是妊娠期出现的具有时间特异性的激素，因此最初作为避孕疫苗设计的理想靶分子。hCG疫苗是目前研究最为成熟的一种免疫避孕疫苗，已完成Ⅱ期临床研究。近年来的研究表明，除了生殖细胞肿瘤如子宫颈癌和子宫内膜癌外，大多数上皮细胞恶性肿瘤也能异位表达hCG类分子，主要以hCGβ形式存在，并随着肿瘤细胞的进一步增殖扩散，其hCG的表达量会不断增加，在肿瘤细胞侵袭转移时其表达量达到最高值。研究表明，hCG在肿瘤生长、血管形成、肿瘤转移和免疫逃逸中起重要作用。因此，hCG作为一种肿瘤相关抗原，其疫苗还可以用于恶性肿瘤的治疗。 hCG与糖蛋白激素家族的其他成员促甲状腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)和黄体生成素(LH)具有相同的α亚基，其中hCGβ亚基与LH的β亚基有较高的同源性，两者前115个氨基酸有82％的同源性。CTP(即hCG羧基端第109-145位氨基酸残基组成的37肽)是hCG分子所特有，它含有hCGβ的线性表位β<,8>和β<,9>，其诱导产生的抗体具有更好的抗原特异性。不足之处是CTP的分子量小，免疫原性差，产生的抗体中和完整hCGβ分子的能力低。 C3d是补体C3的裂解片段，其受体CR2是140 kD的糖蛋白，分布于B细胞、滤泡树突细胞和一些T细胞。C3d与抗原共价连接后，通过其特异性受体CR2将信号提供给免疫细胞，诱导特异性免疫应答。许多研究表明，抗原与3拷贝的C3d连接后在蛋白免疫或基因免疫时可以大大增强该抗原免疫原性。C3d分子作为一种新型分子佐剂引起研究者的关注。 本研究室前期工作已在毕赤酵母和大肠杆菌中成功地表达了CTP二聚体、三聚体、四聚体，并制备了相应的多克隆抗体，证明了hCGβ-CTP多聚体产生的抗体滴度高于单体产生的抗体滴度。 为了进一步提高hCGβ-CTP多聚体的免疫原性，简化疫苗的制备工艺，我们在重组的hCGβ-CTP多聚体的基因上连接了分子佐剂C3d基因的三聚体，构建了真核表达质粒pPIC9Khis6(CTP)n和pPIC9Khis6(CTP)n(n=3，4)3C3d，在毕赤酵母细胞GS115中筛选得到含高拷贝目的基因的克隆并表达目的蛋白。重组蛋白中加入了分子佐剂C3d三聚体，不需要在蛋白表达纯化后再次偶联化学佐剂，简化了疫苗的制备工艺。但是我们发现，虽然我们采用的是毕赤酵母分泌型表达质粒pPIC9K，但是蛋白并没有分泌到培养上清中，而在酵母胞内表达。蛋白的胞内表达、酵母破壁困难、低表达量、背景蛋白多以及非变性条件下his-tag不能与Ni-NTA-Sepharose结合等给纯化带来了很大困难。由于蛋白表达量较低，胞内背景蛋白较多，经过几步纯化，蛋白纯度有所提高，但要得到一定量的蛋白供后续实验有困难。原核表达系统遗传背景清楚，具有成本低、周期短、易操作及表达量高的特点，我们利用原核表达系统对目的蛋白进行了表达。考虑到目的蛋白分子量比较大，表达可能存在困难，构建了原核表达质粒pET=28a(+)-(CTP)<,4>-3C3d和pGEX4T-2-(CTP)<,4>-3C3d，观察蛋白在两种表达载体中的表达情况，但表达不理想，这可能与蛋白分子量太大有关，因为仅3C3d的分子量就可达105 kD。 通过查阅文献，发现来源于C3d分子第1209-1236位氨基酸的P28肽段，在体外可以与CR2阳性的Raji细胞结合，并可被C3d分子竞争性抑制及CR2单抗特异阻断，认为P28肽含有CR2的结合位点。有研究表明来源于该区域的P16肽可诱导小鼠产生更强的抗CEA抗体。含不同拷贝C3d-P28编码基因的重组质粒进行基因免疫，能不同程度地增强HBV-preS2/S诱导的特异性体液免疫及其蛋白加强后的回忆反应，其中4拷贝C3d-P28的增强作用较为显著。因此，我们以P28代替C3d，构建了表达质粒pET-28a(+)-(CTP)<,4>-(C3d-P28)<,4>，一方面大大减小了融合蛋白的分子量，利于表达，另一方面研究C3d-P28对偶联抗原的免疫作用。 我们对培养条件进行了优化，通过Ni-NTA-Agarose和凝胶过滤方法纯化蛋白，得到纯度较高的融合蛋白。Bradford方法定量蛋白，相同分子数的蛋白免疫BALB/c雄性小鼠，共分为三组，Ⅰ组直接用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>免疫，Ⅱ组用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>加弗氏佐剂免疫，Ⅲ组直接用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>-(C3d-P28)<,4>免疫，制备了多克隆抗体。常规ELISA间接法检测抗体效价，我们的结果显示Ⅰ组小鼠产生了较高滴度的抗体(1：8000-12000)，Ⅲ组产生的抗体滴度与Ⅰ组无明显差别，两组产生的抗体滴度均低于Ⅱ组。在本次研究中，4拷贝的C3d-P28对偶联的抗原并未起到增强体液免疫的作用。