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目的： 探讨靶向信号转导子和转录激活子-3(signal transducers and activators of transcription-3，STAT3)对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)细胞生物学行为的影响，探讨靶向STAT3对裸鼠体内RB移植瘤生长的影响及探讨STAT3抑制剂WP1066对体内、外RB细胞生长的影响。 方法： 将人视网膜母细胞瘤细胞株 Y79 细胞作为细胞水平的研究对象；采用将 Y79细胞悬液注射入裸鼠背部皮下的方法建立裸鼠体内RB移植瘤模型，并以此作为大体水平的研究对象。 实验分为三部分： ⑴根据GeneBank(access number NM 31500)得到人STAT3基因mRNA序列，分别在其CCD、SH2、TAD 功能域寻找符合特征的靶序列，合成三条DNA 寡核苷酸链，将其分别命名为STAT3-1，STAT3-2及STAT3-3，然后分别合成STAT3 siRNA1、STAT3 siRNA2、STAT3 siRNA3。应用RNA干涉技术以脂质体转染试剂介导STAT3siRNA靶向转染人RB细胞系后，应用RT-PCR实验检测 Y79 细胞中 STAT3 基因的沉默情况。应用 Western blot 技术检测 RNAi 沉默STAT3的基因表达后，Y79细胞中STAT3蛋白表达的变化。采用MTT方法检测转染前后Y79细胞增殖能力的改变，采用流式细胞检测技术分析转染前后Y79细胞凋亡情况的改变，采用细胞侵袭实验和迁徙实验检测 STAT3siRNA 对细胞转移能力的影响。 ⑵利用RNA干扰技术，将STAT3编码基因特异的shRNA转染入Y79细胞中，构建稳定表达STAT3 shRNA的Y79细胞克隆（STAT3 shRNA/Y79），采用RT-PCR技术检测稳定转染后Y79细胞内STAT3 mRNA表达的变化，采用western blot技术检测稳定转染后Y79细胞内STAT3蛋白表达的变化。进一步将克隆细胞移植于裸鼠背部皮下，通过设立正常对照组、阴性对照组和 shRNA 转染组三组，观察并记录移植瘤的生长情况，并采用TUNEL法检测移植瘤细胞的凋亡率，采用免疫组化技术验证shRNA的特异性基因沉默作用对裸鼠体内RB移植瘤细胞STAT3表达的影响。 ⑶将不同剂量的WP1066作用于Y79细胞，采用western blot实验检测WP1066对体外Y79细胞中STAT3磷酸化的影响，采用MTT、克隆形成实验、TUNEL和流式细胞仪检测WP1066对Y79细胞生长和凋亡的影响；同时将Y79细胞移植于裸鼠背部皮下，成瘤后将30只裸鼠随机分为空白对照组、DSMO治疗组和WP1066治疗组，后两组移植瘤内分别注射DMSO及WP1066溶液，观察并记录三组移植瘤的生长情况，应用TUNEL法及免疫组化技术验证WP1066对裸鼠体内RB移植瘤的抑制作用。 结果： ⑴为了沉默Y79细胞内STAT3的表达，我们选用了3种靶向STAT3不同mRNA区域的siRNA-siRNA1，2和3分别转染Y79细胞48小时，使用RT-PCR和western blot法检查STAT3 siRNA1-3对STAT3的沉默效应。使用不针对任何基因的siRNA作阴性对照。与阴性对照相比， 3种siRNA均显示出明显的沉默效应（P<0.05），并且细胞内STAT3 mRNA的表达降低63.5％-71.6％。其中STAT3 siRNA2对STAT3的抑制作用最明显，本实验选择STAT3 siRNA2并将其重新命名为STAT3 siRNA进行后续实验研究。 STAT3在蛋白质水平的沉默效应也通过了westernblot实验证实，与阴性对照组相比，3种siRNA均显示出明显的沉默效应，其中STAT3 siRNA2转染对Y79细胞内STAT3蛋白表达的抑制作用最为明显，与mRNA水平的沉默效应相一致。为确定STAT3下调是否影响体外Y79细胞活力， 我们用STAT3 siRNA瞬时转染了Y79细胞24-96小时， 用MTT法检测细胞转染24-96小时后的细胞活力。随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低。流式细胞技术证实，靶向STAT3使Y79细胞的凋亡率逐渐增加，表明靶向STAT3通过诱导Y79细胞凋亡而降低细胞增殖率。为了证实靶向 STAT3 对 Y79 细胞侵袭能力的影响，我们对经 STAT3siRNA 转染的 Y79细胞进行了侵袭和迁移试验。与对照细胞相比，转染STAT3 siRNA的Y79细胞的侵袭能力显着降低。划痕实验的结果与上述Matrigel侵袭实验的结果一致。结果表明靶向STAT3可抑制体外细胞迁移和侵袭， STAT3可能在促进Y79细胞的迁移和侵袭中发挥关键作用。 ⑵在STAT3 shRNA稳定转染组的Y79细胞克隆中，STAT3 mRNA相对表达值为0.317士0.014，空白对照组STAT3 mRNA相对表达值为0.986士0.057，而非特异shRNA转染组STAT3 mRNA相对表达值为0.935士0.049。STAT3 shRNA稳定转染组的STAT3 mRNA相对表达值明显低于空白对照组及非特异shRNA转染组，差异有显著性（t=3.867,P=0.004），而空白对照组及非特异shRNA转染组的差异无显著性（P>0.05）。RT-PCR条带也显示，实验组的表达显著下降。这表明，STAT3 shRNA明显降低了STA3 mRNA的表达。在STAT3shRNA稳定转染的Y79细胞克隆，STAT3蛋白的相对表达值为0.08士0.01，明显低于空白对照组0.634士0.13及非特异shRNA转染组0.588士0.14，差异有显著性（t=3.07, P=0.014），空白对照组及非特异shRNA转染组的差异无显著性（P>0.05）。Western blot条带也显示，实验组的条带密度显著下降。同时，免疫组织化学染色发现，STAT3蛋白在STAT3shRNA转染组的表达低于空白对照组及非特异shRNA转染组。各组裸鼠Y79细胞皮下移植瘤在成瘤后开始的2周内均快速生长，但2周以后，逐渐出现明显差别。STAT3shRNA组裸鼠皮下移植瘤的体积增长速度明显慢于空白对照组及非特异 shRNA 转染组，而后两组之间无明显差异。治疗6周后测量 STAT3 shRNA组裸鼠的肿瘤体积为0.31 ± 0.24 cm3，而空白对照组及非特异shRNA转染组分别为0.93 ±0.38 cm3和0.91 ±0.39 cm3，肿瘤的体积差异有统计学意义 (P<0.05)。而空白对照组及非特异shRNA转染组裸鼠皮下移植瘤的体积差异无统计学意义(P>0.05)。实验组的抑瘤率为68.3%，非特异shRNA转染组的抑瘤率为0.06%。治疗6周后切取肿瘤称重，STAT3 shRNA组的平均肿瘤质量为0.38 ±0.21 g，明显低于空白对照组0.85 ±0.52 g及非特异shRNA转染组0.90 ± 0.49 g，差异有统计学意义(P<0.05)。而空白对照组及非特异shRNA转染组裸鼠皮下移植瘤重量差异无统计学意义(P>0.05)。TUNEL检测发现，STAT3 shRNA转染组、空白对照组及非特异 shRNA 转染组的细胞凋亡率分别为（16.8±4.7）、（1.8±0.7）个和（5.3±1.4）个，实验组高于空白对照组及非特异shRNA转染组，差异有显著性（P<0.05）。而空白对照组于非特异shRNA转染组之间无明显差异。 ⑶实验中，我们将Y79细胞暴露于WP1066(0,0.1,1或5μM)48小时或将Y79细胞暴露于5μM WP1066 12-48小时，运用western blot法检测细胞内pSTAT3Tyr705表达的变化。结果所示，在所有测试浓度下，WP1066都明显抑制pSTAT3Tyr705活化，且随着WP1066浓度的增加，这种抑制作用也更加明显。Y79 细胞暴露5μM WP1066 48 小时，pSTAT3Tyr705抑制率>80％。结果表明WP1066剂量依赖性抑制pSTAT3Tyr705活化。同时，在相同的WP1066浓度（5μM）下，随着WP1066作用时间的延长，其对pSTAT3Tyr705活化的抑制作用也更加明显。这表明，WP1066 时间依赖性抑制 pSTAT3Tyr705活化。将Y79细胞暴露于0、0.1、1或5μM WP1066 48小时或Y79细胞暴露于5μM WP1066 12小时，24小时，36小时和48小时。TUNEL染色检测WP1066对Y79细胞凋亡的影响。结果表明，随着WP1066浓度的增加，Y79细胞的凋亡率逐渐增加。随着WP1066作用时间的延长，Y79细胞的凋亡率也逐渐增加。FACS的检测结果与TUNEL的检测结果一致。所以，WP1066通过剂量依赖性和时间依赖性途径诱导Y79细胞凋亡。进一步验证了WP1066的促凋亡作用。将Y79细胞暴露于WP1066（0、0.1、1或5μM） 48小时，然后将Y79 细胞接种在35mm 的培养皿上生长3周。结果表明，WP1066明显降低Y79细胞的集落形成能力。另外，暴露WP1066 24-96小时的Y79细胞的存活率以剂量依赖性和时间依赖性方式降低。在实验中，我们检测了WP1066对裸鼠移植瘤模型中的肿瘤的抑制作用。WP1066治疗组的移植瘤的生长明显被抑制，与对照相比差异有显著性（P<0.05）。 同时，免疫组化检测发现，WP1066治疗组肿瘤内的STAT3 磷酸化明显被抑制。TUNEL 染色发现，WP1066 治疗组肿瘤内存在明显凋亡细胞，与对照相比差异有显著性（P<0.05）。 结论： ⑴靶向STAT3抑制Y79细胞的存活、侵袭和转移，促进Y79细胞凋亡。 ⑵靶向STAT3抑制裸鼠移植瘤生长，STAT3可作为RB治疗的靶基因。 ⑶WP1066可抑制体外Y79细胞及裸鼠体内RB生长，对RB的靶向治疗有很好的临床应用前景。