目的比较肾阴虚、肾阳虚与非肾虚组患者皮质骨及松质骨骨组织蛋白双向电泳(2-DE)图谱的差异,筛选与肾阴虚、肾阳虚证密切相关的蛋白质,在Western Blot和RT-PCR技术验证部分差异蛋白的基础上,应用ELISA技术靶定血清中与骨组织差异表达一致的蛋白质,一方面从骨组织差异蛋白表达层面阐释"肾主骨"理论的科学内涵,另一方面探讨肾阴虚、肾阳虚证潜在血清标志物并丰富它们的客观诊断依据。方法1.获取肾阴虚、肾阳虚及非肾虚组患者皮质骨、松质骨及血液作为研究样本,提取并制备各自的骨组织总蛋白研究样品;采用2-DE技术得到患者皮质骨及松质骨骨组织蛋白质组图谱。2.采用PD Quest软件对肾阴虚、肾阳虚及非肾虚组患者骨组织蛋白质组图谱进行组内一致性分析,并以蛋白点体积变化达1.5倍为标准,对组间差异表达的蛋白点进行靶定。3.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术定性差异表达的蛋白并检索生物信息学数据库,确定并分析差异蛋白名称及其功能。4.在初步确定差异蛋白功能的基础上,结合导师团队前期肾阴虚、肾阳虚大鼠模型骨组织差异蛋白质组研究结果,组间共有的差异蛋白对"肾主骨"理论的研究意义,以及后期血清标志物筛选的依据等因素,故选定肾阴虚、肾阳虚组共有的6个差异表达蛋白:皮质骨中α-烯醇化酶(Eno1)、线粒体热休克蛋白70(Hsp70)、载脂蛋白A-I(ApoA-I),松质骨中骨保护素(OPG)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)及GDP解离抑制因子β(Arhgdib),采用Western Blot和RT-PCR技术对它们的表达情况进行验证。5.应用ELISA技术检测经过上述验证的相关蛋白在各自血清标本中表达情况。6.所有数据用SPSS19.0软件进行分析统计。统计数据用平均值±标准差(x±S)表示。组内比较采用配对t检验和秩和检验,组间比较采用One-wαy ANOVA和LSD检验,P<0.05有显著性差异,P<0.01有极显著性差异。结果1.2-DE获得的肾阴虚、肾阳虚及非肾虚组患者骨组织样本蛋白质组凝胶图谱背景清晰,组内蛋白一致性及辨识度均较好;其中皮质骨、松质骨可辨识总蛋白点数目分别为490个、582个。2.经肾阴虚、肾阳虚及非肾虚组患者骨组织蛋白质组凝胶图谱两两比对,并经质谱鉴定、生物信息学检索显示已知蛋白,分别为:与非肾虚组比较,肾阴虚证患者骨组织有26个蛋白出现差异表达:①皮质骨与松质骨中共有的7个蛋白:α-烯醇化酶、载脂蛋白A-Ⅰ、骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2等4个蛋白上调,GDP解离抑制因子β、翻译控制肿瘤蛋白和骨形态发生蛋白4等3个蛋白下调;②皮质骨中波形蛋白、Ⅰ型胶原α-1链、脱氧尿苷三磷酸酶、维生素D结合蛋白3等4个蛋白上调表达,线粒体热休克蛋白70、增殖细胞核抗原、心肌营养素样细胞因子1与线粒体热休克蛋白90等4个蛋白下调表达;③松质骨中膜联蛋白A1、β微管蛋白2C、线粒体热休克蛋白60、丙酮酸激酶同工酶、破骨细胞生成抑制因子与胰岛素样生长因子结合蛋白3等6个上调表达的蛋白,网钙蛋白3、热休克蛋白B2、N端中段骨钙素、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1、类固醇受体辅助激活因子3等5个下调表达的蛋白。与非肾虚组比较,肾阳虚证患者骨组织有24个蛋白出现差异表达:①皮质骨与松质骨共有7个蛋白:线粒体热休克蛋白90表达上调,骨形态发生蛋白4、骨桥蛋白、GDP解离抑制因子β、酪氨酸激酶受体、丙酮酸激酶同工酶、蛋白质二硫键异构酶A3等6个蛋白表达下调;②皮质骨中载脂蛋白A-Ⅰ、α烯醇化酶、线粒体热休克蛋白70等3个蛋白表达上调,膜联蛋白A1、膜联蛋白A3、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1、Ⅰ型胶原交联氨基末端肽以及骨形态发生蛋白2等5个蛋白表达下调;③松质骨中抗酒石酸酸性磷酸酶、线粒体热休克蛋白60、破骨细胞生成抑制因子、波形蛋白等4个蛋白表达上调,N端中段骨钙素、Ⅰ型胶原α-1链、线粒体ATP合酶亚基α、网钙蛋白3、原肌球蛋白α-4等5个蛋白表达下调。肾阴虚与肾阳虚证患者骨组织有23个差异表达蛋白:①皮质骨方面,以肾阴虚组为参考,肾阳虚组线粒体热休克蛋白70、线粒体热休克蛋白90、线粒体ATP合酶亚基α、锚蛋白重复序列、小分子热休克蛋白和骨形态发生蛋白4等6个蛋白上调表达,骨桥蛋白、α烯醇化酶、过氧化氧化还原蛋白2、成纤维细胞生长因子受体3、骨唾液酸蛋白、GDP解离抑制因子β等6个蛋白下调表达;②松质骨方面,以肾阴虚组为参考,肾阳虚组抗酒石酸酸性磷酸酶、线粒体热休克蛋白60、锚蛋白重复序列和转化生长因子-α等4个蛋白表达上调,骨唾液酸蛋白、丙酮酸透激酶同工酶、膜联蛋白A3、过氧化氧化还原蛋白2、蛋白酶体β亚基9型、磷酸甘油酸激酶1和骨形态发生蛋白4等7个蛋白表达下调。3.扣除肾阴虚、肾阳虚及非肾虚组两两比较中重复出现20个蛋白,剩下41个差异蛋白。41个差异蛋白质根据生物信息学检索可知,其中大部分蛋白与骨组织构成、骨代谢以及骨组织有机物质转运等功能密切相关,如Ⅰ型胶原α-1链、骨形态发生蛋白4等蛋白与骨组织结构与细胞支架构成相关;α-烯醇化酶、成纤维细胞生长因子受体3等蛋白可以在骨细胞代谢过程发挥催化、调节等作用;维生素D结合蛋白3、网钙蛋白3等蛋白与物质转运密切相关。"肾"可能通过调节这些与骨组织关系密切的蛋白表达而发挥"主骨"作用。4.Western Blot 及 RT-PCR 检测皮质骨 Eno1、Hsp70、ApoA-Ⅰ,松质骨 OPG、BMP-4及Arhgdib等蛋白,结果显示,与非肾虚组相比,肾阴虚组皮质骨Eno1、ApoA-Ⅰ呈高表达,皮质骨Hsp70、松质骨BMP-4、Arhgdib、OPG呈低表达;肾阳虚组皮质骨Eno1、Hsp70及ApoA-Ⅰ呈高表达,松质骨BMP-4、Arhgdib、OPG呈低表达。与肾阴虚组相比,肾阳虚组皮质骨中Hsp70和松质骨OPG呈高表达,皮质骨Eno1、松质骨BMP-4呈低表达,而皮质骨ApoA-Ⅰ及松质骨Arhgdib未有显著性差异。5.Eno1、Hsp70、ApoA-Ⅰ、OPG、BMP-4 和 Arhgdib 等蛋白血清 ELISA 检测结果显示,相对于非肾虚组,肾阴虚组Hsp70、BMP-4和Arhgdib含量降低,Eno1、ApoA-Ⅰ、OPG含量升高,肾阳虚组ApoA-Ⅰ、BMP-4和Arhgdib含量降低,Eno1、OPG和Hsp70含量升高。相对于肾阴虚组,肾阳虚组Hsp70升高,BMP-4和Arhgdib降低。其中Hsp70、BMP-4在血清表达趋势与骨组织一致;肾阴虚组血清APoA-Ⅰ升高,与骨组织中表达一致,而肾阳虚组血清与骨组织不同;肾阴虚、肾阳虚组血清Eno1、Arhgdib、OPG检测结果与它们在骨组织表达不一致。结论1.较之非肾虚组,肾阴虚证者皮质骨存在Ⅰ型胶原α-1链、脱氧尿苷三磷酸酶等15个差异蛋白,松质骨中有膜联蛋白A1、β微管蛋白2C等18个差异蛋白,肾阳虚证者皮质骨存在骨形态发生蛋白4、骨桥蛋白等15个差异蛋白,松质骨有线粒体热休克蛋白60、破骨细胞生成抑制因子等16个差异蛋白,这些差异表达蛋白大多数都与骨组织结构构成、骨代谢调节以及物质转运等功能相关,提示它们可能都参与"肾主骨"过程。"肾"对这些蛋白差异表达的调控,可能是"肾主骨"理论的科学内涵之一。2.由肾阴虚与肾阳虚证患者骨组织差异蛋白分析可知,皮质骨中线粒体热休克蛋白90、线粒体ATP合酶亚基α等12个存在表达差异,松质骨中波形蛋白、破骨细胞生成抑制因子等11个也存在表达差异,这些是肾阴虚、肾阳虚证的微观实质之一,是肾阴虚、肾阳虚状态骨组织结构及功能差异的物质基础。3.肾阴虚状态下Hsp70低表达、ApoA-Ⅰ高表达,肾阳虚状态下Hsp70高表达,经2-DE、Western Blot、RT-PCR及血清ELISA等多种方法检测,结果相互印证且表达趋势一致,它们可作为肾阴虚、肾阳虚证血清潜在标志物,同时可以补充肾虚证临床诊断的依据。